一种经G插入序列合成的发光银簇对卡托普利的检测方法与流程

本发明涉及一种经g插入序列合成的发光银簇对卡托普利的检测方法，属于食品、药品检测领域。

背景技术：

银纳米簇(agncs)作为一种纳米材料，具有光致发光特性和催化活性，在分析化学、生物医学、细胞成像等领域广泛应用。以天然生物dna为模板合成的dna-agncs具有荧光特性，其荧光强度与dna序列中的基因排列和结构有关。研究发现，ag⁺可以选择性地配位c碱基并形成稳定的c-ag⁺-c复合物，g(鸟嘌呤)富集的序列可以提高dna-agncs在检测核酸、atp、凝血酶和重金属时的荧光强度，而且一些具有高荧光强度的dna封端的agncs通常富含c和g碱基的序列，所以创造性设计一系列规则的dna序列，以探索插入g碱基的富c序列合成的dna-agncs的荧光强度，可以帮助了解dna碱基中的规则，并获得高荧光亮度的序列。

卡托普利[1-(d-3-巯基-2-甲基-1-氧代丙基)-l-脯氨酸，简称cap]，是第一代用于治疗高血压的主要用于治疗高血压、冠心病和充血性心力衰竭的血管紧张素转换酶抑制剂。由于卡托普利便宜易得，商家可能会将其非法添加到某些可降低血压的保健品中以提高效果。

目前常用的卡托普利检测手段有气相色谱法、液相-质谱连用法、高效液相色谱法等，这些方法或耗时长、成本高，且需要在专门的实验室中由专业的实验人员进行，或灵敏度低，且容易造成环境污染。由于含巯基药物通过巯基与银纳米簇发生特异性作用,可以高选择性猝灭银纳米簇的荧光。本发明利用筛选得出的g插入序列合成的dna-agncs，具有较高的荧光亮度，并建立了一种新的卡托普利检测方法，操作简单，反应速度快，灵敏度高，可视化程度高。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种卡托普利的荧光检测方法，应用g插入的dna合成荧光核酸纳米银簇dna-agncs，实现对卡托普利简单、快速、灵敏地进行检测。

在本发明的一种实施方式中，所述dna-agncs含有seqidno.1所示的dna。

在本发明的一种实施方式中，所述dna-agncs按下述步骤制备而成：将dna加入至磷酸盐缓冲液中，配制成dna溶液，再加入agno3水溶液，搅拌20～30s，在0～4℃环境下保持15～30min后，加入nabh4溶液并剧烈搅拌1～2min，将此混合物在室温下避光保存8～12h；所述dna、agno3和nabh4的摩尔比为1:6:6。

在本发明的一种实施方式中，所述dna-agncs按下述步骤制备而成：将dna加入至磷酸盐缓冲液中，获得浓度为5μm的dna溶液，再按照dna：agno3＝1：6的比例加入agno3水溶液，搅拌20～30s，在0～4℃环境下保持15～30min后，按照dna：nabh4＝1:6的比例加入nabh4溶液并剧烈搅拌1～2min，将此混合物在室温下避光保存8～12h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)向所述的dna-agncs纳米簇溶液，加入终浓度为0.1～5mg/l的卡托普利溶液，室温下混合反应20min，于670nm发射光波长下测定荧光强度，建立卡托普利浓度-荧光强度标准曲线；

(2)卡托普利的检测：取待测样品加入至上述银纳米簇溶液中，反应体系为400μl，银簇终浓度为2.5μm，同时加入等量的水作空白对照，20min后，于670nm发射光波长下分别测定荧光强度，与空白对照相比，若荧光强度明显减弱，则该样品含卡托普利。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还用于测定样品中的卡托普利浓度，方法的具体步骤包括：

(1)向dna-agncs纳米簇溶液中加入终浓度为0.1～5mg/l的卡托普利溶液，室温下混合反应20min，于670nm发射光波长下测定荧光强度，建立卡托普利浓度-荧光强度标准曲线；

(2)取待测样品加入至上述银纳米簇溶液中，待测样品与银纳米簇溶液的体积比为1～5:1，混合后反应15～20min，于670nm发射光波长下测定荧光强度，将待测样品的荧光强度带入至步骤(1)制备的卡托普利浓度-荧光强度标准曲线，计算待测样品中的卡托普利浓度。

本发明的第二个目的是提供一种高亮度荧光核酸纳米银簇dna-agncs，是将含有seqidno.1所示的dna与agno3、nabh4为原料，在磷酸盐缓冲液中制备而成。

在本发明的一种实施方式中，所述荧光核酸纳米银簇dna-agncs是按照下述方式制备而成：取20μl磷酸盐缓冲液，加入终浓度为5μm的dna水溶液，再加入2.0μl浓度为3.0mm的agno3水溶液，搅拌30s，在4℃环境下保持20min后，加入2.0μl新制的nabh4水溶液并剧烈搅拌1min，将此混合物在室温下避光保存9h，制成dna-agncs纳米簇溶液；

本发明的第三个目的是提供seqidno.1所示的dna在荧光检测领域方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备荧光核酸纳米银簇dna-agncs。

有益效果：本发明中合成的dna-agncs，采用的dna是经过一系列筛选获得的高荧光亮度的序列，对检测卡托普利具有简单、快速、便携、可视化、灵敏度高等优点，检测灵敏度可达0.05μg/ml，检测线性范围为0.05μg/ml～5μg/ml，可以快速准确地提供检测结果。

附图说明

图1为长度相当的10个不同富c碱基的dna序列合成的dna-agncs荧光强度对比图，发射波长为670nm，dna序列从左到右分别为c6t、c4t、c3t、c6a、c4a、c3a、c6g、c4g、c3g、c12；

图2为g碱基数目及插入位置不同的富c碱基的dna序列合成的dna-agncs荧光强度对比图，发射波长为670nm，dna序列从左到右分别为c6g、c4g、c3g、c2g、cg、c12；

图3为g碱基数目不同的富c碱基的dna序列合成的dna-agncs荧光强度对比图，发射波长为670nm，dna序列从左到右分别为c6g、c6-2g、c6-3g、c6-4g、c6-5g、c6-6g；

图4为c6-5g-agncs的飞行时间质谱和透射电子显微镜表征图；

图5为本发明实施例2中测定卡托普利和agncs的反应稳定时间的荧光强度趋势图；

图6为本发明实施例2中卡托普利浓度-荧光强度标准曲线图；

图7为本发明实施例3中对于不同物质的选择性分析对比图，样品从左到右分别为空白、浓度为1μg/ml的卡托普利、50μg/ml的淀粉、50μg/ml的糊精、10μg/ml的麦芽糖、20μg/ml的明胶、10μg/ml的蔗糖、50μg/ml的乳糖、10μg/ml的葡萄糖的荧光强度。

图8为本发明实施例4中对于茶样中卡托普利检测的分析图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不仅仅局限于下述实例。

实施例1

采用如下条件制备dna-agncs溶液：

(1)dna-agncs溶液的制备：取20μl磷酸盐缓冲液，加入终浓度为5μm的dna水溶液，再加入2.0μl浓度为3.0mm的agno3水溶液，搅拌30s，在4℃环境下保持20min后，加入2.0μl新制的nabh4水溶液并剧烈搅拌1min，将此混合物在室温下避光保存9h，制成dna-agncs纳米簇溶液；

(2)dna序列的筛选：选择表1中不同的富c碱基的dna序列，按步骤(1)合成dna-agncs，测定其在最大发射波长(670nm)的荧光强度，结果如图1所示，c4a和c6g序列对应的荧光强度较强，分别为26730和27394，可知c6g序列强度最高，故选择g插入序列进一步实验；

表1长度相当的10个不同富c碱基的dna序列

选择g碱基数目及插入位置不同的富c碱基的dna序列(表2)，按步骤(1)合成dna-agncs，测定其在最大发射波长(670nm)下的荧光强度，结果如图2所示，c6g序列对应的荧光强度最强，达到27394；

表2g碱基数目及插入位置不同的富c碱基的dna序列

选择g碱基数目不同的富c碱基的dna序列(表3)，按步骤(1)合成dna-agncs，测定其在最大发射波长(670nm)下的荧光强度，结果如图3所示，c6-5g序列对应的荧光强度最强，达到41963；

表3g碱基数目不同的富c碱基的dna序列

(3)dna-agncs的表征：选择荧光亮度最好的dna序列(c6-5g)，合成dna-agncs纳米簇溶液，以罗丹明b为标准对照测定量子产率为28％，通过飞行时间质谱和透射电子显微镜对该纳米银簇进行表征，结果如图4所示，其中5054峰表示c6-5gdna序列的质量比，而5162峰表示c6-5g-agncs的质量比，差值为108，恰好是一个ag原子，表明每个c6-5g银纳米簇含有一个ag；用tem拍摄的agncs图像如图4插图所示，可知c6-5g-agncs具有非常小的尺寸(<2nm)；

(4)确定反应稳定时间：选择荧光亮度最好的dna序列(c6-5g)，按步骤(1)合成c6-5g-agncs纳米簇溶液，总反应体积为400μl，其中c6-5g-agncs浓度为2.5μm，加入终浓度为1μg/ml的卡托普利，使用荧光光谱仪的时间测量模块来测量荧光强度以及反应时间，每5s记录一次数据，实验结果如图5所示，dna-agncs峰值荧光强度随时间显着下降，然后在约1200s时保持平衡，故选择1200秒(20分钟)作为反应平衡时间；

实施例2

向实施例1制备的浓度为2.5μm的c6-5g-agncs纳米簇溶液中加入不同浓度的卡托普利，总反应体积为400μl，卡托普利终浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/ml，充分反应20min后，于670nm发射光波长下测定荧光强度，由此建立卡托普利浓度-荧光强度标准曲线，如图6所示，在卡托普利浓度范围(0～1μg/ml)内有较好的线性关系，线性方程为y＝-42774.68x+45953.36(r²＝0.9446)。检测灵敏度可达0.05μg/ml，检测线性范围为0.05μg/ml～5μg/ml。

实施例3

总反应体积为400μl，其中c6-5g-agncs浓度为2.5μm，向c6-5g-agncs纳米簇溶液中分别加入浓度为1μg/ml的卡托普利，50μg/ml的淀粉、50μg/ml的糊精、10μg/ml的麦芽糖、20μg/ml的明胶、10μg/ml的蔗糖、50μg/ml的乳糖、10μg/ml的葡萄糖，并作空白对照，充分反应20min后，于670nm发射光波长下测定荧光强度，以确定c6g5-agncs对卡托普利检测的选择性，结果如图7所示，只有添加有卡托普利的c6-5g-agncs在荧光中被明显猝灭，空白对照的荧光强度为72251，卡托普利组为7737，淀粉组为63195，乳糖组为50311，且在图7(b)中可直接观察到加入卡托普利的样品的亮度远弱于其他八个，表明c6g5-agncs用于检测卡托普利的选择性很好。

实施例4

应用不含卡托普利的的茶样对实施例3的检测方法进行验证。

称取2g青钱柳茶加至200g95℃热水中，浸提10min，过滤并冷却至室温；取浸提液，加入c6-5g-agncs水溶液，二者体积比为1:1；总反应体积为400μl，其中c6-5g-agncs浓度为2.5μm，同时将另一相同体积和浓度的c6-5g-agncs在水中作空白对照，20min后，分别测定荧光强度，确定茶样中是否含有卡托普利，结果如图8所示，实线黑色线表示空白对照组(以水作为溶剂的c6-5g-agncs)荧光光谱，灰色实线表示c6-5g-agncs的荧光光谱(以青钱柳提取物作为溶剂)。可以看出，两组之间的荧光强度只有轻微的差异，这表明该茶样中不含卡托普利，茶样中也没有任何影响agncs荧光强度的因素。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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