一种基于氮化碳信号放大的光电化学传感器及其制备和应用的制作方法

本发明属于电化学传感器领域，具体涉及一种基于氮化碳信号放大的光电化学传感器及其制备方法。

背景技术

四环素类抗生素是20世纪40年代发现的一类广谱抗生素。这一类抗生素广泛应用于人体或者是饲养动物中细菌、细胞内支原体、衣原体等引起的感染的治疗。但是，四环素的滥用致使其通过直接服用药物或通过间接食用动物性食品在人体内累积，这将产生一些严重的风险，如增加微生物菌种对药物的耐药性、对一些敏感性人群产生过敏或毒性反应，并会抑制骨生长。而且，早自1956年，就已经发现四环素有可能影响牙齿的发育和形成，不但使牙齿变黄，还会引起牙釉质发育不良或牙齿畸形。因此，四环素的检测与环境监测有着重要的社会意义。

目前四环素的检测方法主要有以下几种：

（1）等离子共振检测法：该方法是通过密切监测折射率(ri)提供实时和目标质量依赖的信号。此方法成本较高，前期处理较复杂。

（2）电化学发光法检测：方法测量精度高，检测范围广，但是在稳定性和特异性方面有待提高。

（3）液质联用法检测：该方法虽然可以实现高灵敏度，高选择性检测，但操作复杂，且仪器成本相对较昂贵，检测时间较长。

（4）光电化学传感器法：光电化学分析的灵敏度高，而且背景信号低，操作便捷、设备简单、检测成本低，但常常存在选择性不足的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于氮化碳信号放大的四环素光电化学传感器的制备方法。该传感器构造简单、成本低廉、选择性高。

为实现本发明的目的，采用如下技术方案：

一种基于氮化碳信号放大的光电化学传感器的制备方法，以g-c3n4为光活性材料，以待测物质的适配体为生物识别元件，以gan为工作电极；将g-c3n4和待测物质的适配体加入电解液中，与三电极系统一起构成基于氮化碳信号放大的光电化学传感器。

g-c3n4在电解液中的浓度为0.66~19.8mg/ml。

待测物质的适配体在电解液中的浓度为40nm~120nm。

所述的三电极系统是以铂电极为对电极，ag/agcl电极作为参比电极。

一种如上所述的制备方法制得的基于氮化碳信号放大的光电化学传感器。

一种如上所述的基于氮化碳信号放大的光电化学传感器的应用：用于溶液中的四环素检测，此处所指的溶液可以是食品、药品等配制成的溶液。

该传感器用于溶液中的四环素检测时，更为具体的：是将待测体系加入到所述的基于氮化碳信号放大的光电化学传感器的电解液中，联用紫外灯（波长一般为350～400nm）对电解液进行辐照，在有四环素存在的体系中，所述的氮化碳信号放大的光电化学传感器会产生光电流增强，通过绘制已知四环素的浓度和光电流的标准曲线，由所述的基于氮化碳信号放大的光电化学传感器检测到的光电流即可确定待测体系中四环素的浓度。

用于溶液中的四环素检测时，所用的适配体的序列为5′-cgtacggaattcgctagccccccggcaggccacggcttgggttggtcccactgcgcgtggatccgagctccacgt。

用于溶液中的四环素检测时，检测范围为0.1-10nmol/l，四环素的检测限为0.03nm。

用于溶液中的四环素检测时，gan工作电极的偏电压为+0.2-+0.6v。

更进一步的，本发明的传感器用于四环素的检测时，其制备方法为：以g-c3n4为光活性材料，以四环素适配体为生物识别元件，以na2so4溶液为电解液，以gan为工作电极，以铂电极为对电极，ag/agcl电极作为参比电极，组装成四环素光电化学传感器。

更进一步的，其制备方法具体包括以下步骤：

①将四环素dna适配体用pbs缓冲液配制后，在na2so4溶液中加入四环素dna适配体和g-c3n4，得混合液；以gan为工作电极，铂电极为对电极，ag/agcl电极作为参比电极，以混合液为电解液，在三电极系统中测量365nm辐照下的光电流，即为背景光电流；

②将步骤①的混合液分别与一系列等体积不同浓度的四环素标准溶液混合，室温孵育5-20min后，得一系列待测试液；

③以gan为工作电极，铂电极为对电极，ag/agcl电极作为参比电极，分别以步骤②制得的一系列待测试液为电解液，在三电极系统中测量365nm辐照下的光电流；将步骤③测得的光电流与步骤①背景光电流的差值δi作为y值，四环素标准溶液的浓度为x值，得到线性回归方程；

④将待测的四环素样品添加到步骤①的混合液中，室温孵育5-20min后，再次测量光电流，将其与步骤①背景电流的差值δi代入步骤③的线性回归方程中，得到待测样品中四环素的含量。

优选的，步骤②所述的待测试液中，四环素dna适配体的浓度为60nm；g-c3n4的浓度为13.2mg/ml；四环素标准溶液的浓度范围为0.1-10nmol/l，体积为5μl；三电极系统中，gan电极上的偏电压为0.4v。

本发明传感器检测四环素的作用机理为：

本发明采用在水中具有良好分散性的g-c3n4为光活性材料，结合四环素dna适配体为生物识别元件，提供了一种用于四环素特异性检测的新型光电化学适配体传感器的制备方法。由于g-c3n4/gan这两种材料的能带结构具有良好的匹配性，光生空穴和电子在gan和g-c3n4之间，可以很容易地转移。在光照射下，电子从g-c3n4的价带激发到其导带，然后转移到gan的导带上。另外，在g-c3n4的价带中可产生空穴，并参与tet的氧化，并显著地抑制了光生电子空穴载流子的复合。因此，光电流的显著增强。

同理，检测其他物质时，选取相应可特异性结合该物质的适配体即可。

本发明与现有技术比较具有以下优点：

1）本发明基于g-c3n4/gan这两种材料的能带结构具有良好的匹配性，光生空穴和电子在gan和g-c3n4之间，可以很容易地转移；在光照射下，电子从g-c3n4的价带激发到其导带，然后转移到gan的导带上；另外，在g-c3n4的价带中可产生空穴，氧化待测物质，从而显著地抑制了光生电子空穴载流子的复合；因此当待测体系中存在待测物质时，光电流显著增强，可用于体系中的待测物质含量的测量；该传感器构造简单、成本低廉、选择性高；

2）本发明的传感器用于四环素检测时，对四环素还具有高选择性，而金霉素，硫酸新霉素，氯霉素，硫酸卡那霉素和强力霉素等对检测基本无干扰；本发明的传感器对四环素的响应在0.1-10nmol/l范围内呈线性，检出限(3s/n)为0.03nm；该传感器解决了以往四环素检测方法或装置昂贵、过程复杂或选择性不足等问题，提供了一种构造简单、成本低廉、选择性高的四环素传感器，可应用于四环素的医学检测和环境监测。

附图说明

图1为本发明传感器的工作原理图；tet—四环素；aptamer—适配体；

图2为光电流响应图；（a）gan电极的光电流响应图；（b）加入13.2mg/mlg-c3n4的光电流响应图；（c）继续加5nmol/ltet的光电流响应图；介质：0.01mna2so4；偏压电位(vssce)：+0.4v；激发光波长：365nm；适配体：40nm；

图3为不同浓度的g-c3n4在三电极系统对tet的光电流响应的影响；（a）0.66，（b）6.6，（c）13.2，（d）16.5，（e）19.8mg/ml；

图4为不同浓度的适配体对于tet上的光电流响应的影响：（a）40nm（b）60nm（c）80nm（d）100nm（e）120nm；在0.01mna2so4和13.2mg/mlg-c3n4中，在+0.4v的偏压电位下记录pec测量，差棒=sd（n=5）；

图5为对于gan电极上的40nm适配体的偏置电压对光电流响应的影响：（a）0.2，（b）0.3，（c）0.4，（d）0.5，（e）0.6v；在0.01mna2so4和13.2mg/mlg-c3n4中，在+0.4v的偏压电位下记录pec测量，误差棒=sd（n=5）；

图6为本发明的传感器使用60nm适配体和13.2mg/mlg-c3n4，对各种抗生素的pec响应；在0.01mna2so4和13.2mg/mlg-c3n4中，在+0.4v的偏压电位下记录pec测量（n=5）；

图7为使用60nm适配体和在不同浓度的gan电极上朝向tet的13.2mg/mlg-c3n4的光电流响应的校准曲线；pec测量结果记录在0.01mna2so4上，偏压电位为+0.4v，误差棒=sd（n=3）。

具体实施方式

为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。

本发明以四环素的检测为例，进行详细说明。其他待测物质参照四环素的检测进行即可。

以na2so4溶液（0.01m）为电解液，加入适量四环素（tet）适配体（dna适配体是用下面的序列：5′-cgtacggaattcgctagccccccggcaggccacggcttgggttggtcccactgcgcgtggatccgagctccacgt）和g-c3n4，用如图1所示三电极系统测量在365nm辐照下的光电流信号，其中gan为工作电极，铂电极为对电极，ag/agcl电极作为参比电极。每个光电流信号测试重复三次取平均值。如图2所示，随着光照的开、关，光电流分别急剧增加和快速下降，说明了光电阴极具有快速光响应。测得在365nm照射下的背景光电流后，将待测的四环素样品被添加到该溶液中，室温孵育5-20min后，再次测量光电流，其与背景电流的差值为相应tct浓度的响应。

增加g-c3n4浓度，光电流明显增加（图3）。基于光诱导电荷载体分离，使得电子从g-c3n4作为电子转移到gan电极。当g-c3n4的浓度超过13.2mg/ml时，光电流下降。这个结果可能是由于过量的g-c3n4会阻止光生电子的转移，因此使用13.2mg/ml来制造pec传感器。

dna分子在糖链（磷酸主链）上带有负电荷的磷酸基团，在水溶液中每个碱基具有一个负电荷。g-c3n4纳米片带正电荷，为固定四环素适配体提供了极好的平台。

图4显示了适配体浓度对光电流响应的影响。观察到对tet的pec响应随着适配体浓度从40nm增加到120nm而显著增加。该结果与固定在g-c3n4上的较高浓度的适配体可捕获更多tet分子的事实一致。然而，当适体浓度超过60nm时，pec响应降低。过量的适配体所产生的空间位阻可能导致电子传递的阻塞。因此选择60nm适配体用于制造传感器。

光生电子将通过外部电路的偏置电位被驱动到反电极，因此有助于产生高光电流。偏置电位也对传感器的pec响应显示出明显的影响。如图5所示，tet的光电流响应随着偏压电势从0.2v增加到0.6v而增加，这表明较大的阳极偏压电势可以驱动更多光生电子到对电极上从而更有效地抑制空穴−电子对的复合。然而，当施加的电势大于0.4v时，对tet的响应没有显示出进一步的增强，这可能是由于tet消耗的光生空穴饱和所致。因此，0.4v是用于pec感测的最佳电势。

为了研究这种pec适体传感器的选择性，我们在0.01mpbs溶液中孵育含有5nm各种抗生素（包括四环素，金霉素，硫酸新霉素,氯霉素，硫酸卡那霉素）后，记录适配体/g-c3n4在0.01mna2so4溶液中对gan电极的响应。与tet不同，所有这些抗生素对gan电极上的适体/g-c3n4都没有表现出明显的响应（图6），这表明由于适体和靶tet分子之间的特异性识别，所提出的传感器具有高选择性。此外，还评估了pec适体传感器的重现性。

随着四环素浓度的增加，光电流强度逐渐增加，光电流强度相对于目标浓度的曲线在0.1至10nm范围内对于靶具有良好的线性关系。线性回归方程表示为δi/a=1.53e^-4+2.45e^-4lg[c/（nmol/l）]，相关系数为0.997，范围为0.1-10nmol/l。根据3δ计算的四环素的检测限（lod）为0.03nm。这与以前报道的用于四环素分析的大多数方法相当或更敏感。

这些结果表明基于g-c3n4的光电流纳米探针可用于在均匀溶液中以高灵敏度定量分析物。5nmol/l（n=5）的四环素检测响应的相对标准偏差（rsd）为5.3%。

实验结果表明，该pec传感平台采用13.2mg/ml的g-c3n4，适配体浓度为60nm，偏压为0.4v，在ph为7.4的pbs缓冲液(0.01m)反应条件下，呈现出最优的光电流响应。线性回归方程表示为δi/a=1.53e^-4+2.45e^-4lg[c/(nmol/l)]，相关系数为0.997，范围为0.1-10nmol/l。根据3δ计算的四环素的检测限(lod)为0.03nm。以金霉素，硫酸新霉素，氯霉素，硫酸卡那霉素和强力霉素作为干扰物，该传感平台对其响应信号远小于其对四环素的响应信号。

实施例1

一种基于氮化碳信号放大的四环素光电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）标准曲线的建立：

①将四环素dna适配体用ph=7.4的pbs缓冲液配制后，在0.01mna2so4溶液中加入四环素dna适配体和g-c3n4，得混合液；以gan为工作电极，铂电极为对电极，ag/agcl电极作为参比电极，以混合液为电解液，在三电极系统中测量365nm辐照下的光电流，即为背景光电流；

②将步骤①的混合液分别与一系列等体积不同浓度的四环素标准溶液混合，室温孵育5-20min后，得一系列待测试液；

③以gan为工作电极，铂电极为对电极，ag/agcl电极作为参比电极，分别以步骤②制得的一系列待测试液为电解液，在三电极系统中测量365nm辐照下的光电流；将步骤③测得的光电流与步骤①背景光电流的差值δi作为y值，四环素标准溶液的浓度为x值，得到线性回归方程为：y（a）=1.53e^-4+2.45e^-4lg[x/(nmol/l)]，相关系数为0.997；

（2）实际试样的检测：

将待测的牛奶样品添加到步骤①的混合液中，室温孵育5-20min后，再次测量光电流，将其与步骤①背景电流的差值δi代入步骤③的线性回归方程中，得到待测样品中四环素的含量。

步骤②所述的待测试液中，四环素dna适配体的浓度为60nm；g-c3n4的浓度为13.2mg/ml；四环素标准溶液的浓度范围为0.1-10nmol/l，体积为5μl。

表1：测定牛奶样品中四环素的回收率实验结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110>福州大学

<120>一种基于氮化碳信号放大的光电化学传感器及其制备和应用

<130>1

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<170>siposequencelisting1.0

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