一种三螺旋pH生物传感器及其应用的制作方法

本发明涉及一种三螺旋ph生物传感器及其应用，属于生物传感器制备领域。

背景技术：

从化学反应到生命有机体，不论是简单的变化或是复杂的反应都与ph值密切相关。对ph值进行监测，能帮助人们更好地理解微观世界的变化。例如，人体体液ph值异常会影响免疫系统或神经系统，甚至与癌症等重大疾病密切相关。因此，对ph值及其变化进行精准测量具有重要意义。

目前，ph测量方法主要有ph试纸、氢电极、醌氢醌电极、锑电极、pd-hph指示电极、光导纤维ph传感器等。ph试纸操作简便，但是测量结果人为误差较大，不适合精准测量。醌氢醌电极虽制备简单、使用方便、电位精确，但却不能长久放置，且在ph>8时不能使用，易受氧化剂、还原剂的影响。锑ph指示电极很大程度上依赖于电极表面的状态，所以表现出较差的稳定性和重现性。氢电极由于装置的复杂性，一般只用做ph测定的基准参考电极，即标准氢电极。pd-hph指示电极制备简单，ph测量范围广，可用于非水体系的检测，但其不耐高温，强度不高，难以用于特殊环境下ph的测量。光导纤维ph传感器测量精度高，但其ph值的线性范围一般较窄。随着现代环境科学、生命医学、分析科学等的进步与发展，对ph值的检测提出越来越多的要求，传统ph检测方法面临极大的挑战。

因此，目前需要研究一种操作简便、成本低廉、检测范围宽、测量精准、性能稳定的ph值检测方法。

技术实现要素：

本发明基于不同ph值下dna杂交过程的不同设计生物传感器，实现对ph值的精准检测，有望为生物医学的研究提供有效信息，对相关疾病的诊断和临床研究具有重要意义。

本发明的目的之一是提供一种三螺旋ph生物传感器。

本发明的目的之二是提供所述三螺旋ph生物传感器的应用。

本发明的目的之三是提供一种检测ph的方法。

为实现上述目的，本发明具体采用以下技术方案：

首先，本发明提供一种三螺旋ph生物传感器，该生物传感器包括两种发夹dna(h1和h2)、单链引发dna(i)、捕获探针(ut)和羧基化磁珠，各链的结构特点是：h1链从5'端至3'端依次包括序列a、序列b、序列c和序列b*，5'末端修饰荧光基团；h2链从5'端至3'端依次包括序列b*、序列a*、序列b和序列c*，3'末端修饰荧光基团；i链从5'端至3'端依次包括序列b*和序列a*，3'末端修饰氨基，i链3'末端的氨基与羧基化磁珠能够形成i链/磁珠复合物；ut链从5'端至3'端的序列为b；其中，所述序列a和a*为互补序列，序列b和b*为互补序列，序列c和c*为互补序列。

其次，本发明提供所述三螺旋ph生物传感器在检测ph中的应用。

最后，本发明提供一种检测ph的方法，该方法包括使用所述三螺旋ph生物传感器进行检测的步骤。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：

基于不同ph值下dna组装方式的不同可实现ph值在4.0到9.0范围内信号的快速、准确响应，具有成本低廉、操作简便、反应快速、灵敏度高等优点，该体系有望应用于基于ph值控制的dna纳米技术的生物诊断领域，即可通过不同ph值下dna组装方式的不同诊断疾病的发生与发展，在药物输送等方面具有潜在的应用前景。

附图说明

构成本发明一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明的实验原理图。

图2是非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3是荧光标准工作曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有的ph检测方法存在一定的不足，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种三螺旋ph生物传感器，该生物传感器体系包括两种发夹dna(h1和h2)、单链引发dna(i)、捕获探针(ut)和羧基化磁珠，各链的结构特点是：h1链从5'端至3'端依次包括序列a、序列b、序列c和序列b*，5'末端修饰荧光基团；h2链从5'端至3'端依次包括序列b*、序列a*、序列b和序列c*，3'末端修饰荧光基团；i链从5'端至3'端依次包括序列b*和序列a*，3'末端修饰氨基，i链3'末端的氨基与羧基化磁珠能够形成i链/磁珠复合物；ut链从5'端至3'端的序列为b；其中，所述序列a和a*为互补序列，序列b和b*为互补序列，序列c和c*为互补序列。

在本发明的一个实施方式中，在酸性条件下，发夹h1链、h2链的双螺旋茎部与ut链结合，形成反hoogsteen键的三螺旋发夹结构m1、m2；加入i链/磁珠复合物后，i链无法发生toehold介导的链取代反应。

优选的，所述酸性条件是指ph＝4.0-6.0。

在本发明的一个实施方式中，在中性及碱性条件下，发夹h1链、h2链与ut链共存在溶液中，无法形成三螺旋结构；加入i链/磁珠复合物后，基于toehold介导的链取代反应，i链序列a*与h1链的toehold区域a互补杂交，引发链迁移过程，使h1链的发夹结构打开，裸露出c-b*序列；溶液中h2链的toehold区域c*与h1链打开后裸露的单链dna序列c互补杂交，引发链迁移过程，使h2链的发夹结构打开，裸露出a*-b*序列；h2链打开后裸露的单链dna序列a*-b*与i链的序列相同，引发新一轮反应，继而实现h1链、h2链的持续组装，在磁珠表面形成长的双链dna结构。

优选的，所述中性及碱性条件是指ph＝7.0-9.0。

在本发明的一个实施方式中，本发明所述的互补序列为完全互补序列。

在本发明的一个实施方式中，提供了序列a、序列b、序列c、序列a*、序列b*、序列c*的具体序列，分别为：5'-tacagc-3'，5'-gaggaagggagaagagga-3'，5'-taggag-3'，5'-gctgta-3'，5'-tcctcttctcccttcctc-3'，5'-ctccta-3'。

在本发明的一个实施方式中，所述i链的序列为5'-tcctcttctcccttcctcgctgta-3'，如seqidno:1所示，h1链的序列为5'-tacagcgaggaagggagaagaggataggagtcctcttctcccttcctc-3'，如seqidno:2所示，h2链的序列为5'-tcctcttctcccttcctcgctgtagaggaagggagaagaggactccta-3'，如seqidno:3所示，ut链的序列为5'-gaggaagggagaagagga-3'，如seqidno:4所示。

需要说明的是，本发明不仅仅限于以上具体序列，还可以是其他的序列，根据上述各链的结构特点，本领域的技术人员可设计多种序列，以实现本发明的发明目的。

在本发明的一个实施方式中，所述荧光基团为alexafluor488，该荧光基团的荧光特性不随ph变化。

在本发明的一个实施方式中，所述磁珠为聚苯乙烯磁珠，可较好的实现磁分离。

在本发明的一个典型实施方式中，提供所述三螺旋ph生物传感器在检测ph中的应用。

在本发明的又一个典型实施方式中，本发明提供一种检测ph的方法，该方法包括使用所述三螺旋ph生物传感器进行检测的步骤。

在本发明的一个实施方式中，待检测样品包括但不限于缓冲液或者其他不同ph值的溶液，例如，生物机体的体液。

在本发明的一个实施方式中，提供一种检测ph的方法，该方法包括：

(1)制作标准曲线：

用ph＝7.0的tae缓冲液稀释引发链i链、发夹h1链、h2链和捕获探针ut链；

发夹h1链和h2链分别退火；

制备i链/磁珠复合物(ph＝7.0)；

取退火后的发夹h1链和h2链各2μl与4μlut链混合，并加入到不同ph值(ph＝4.0-9.0)的tae缓冲液中进行反应；优选的，所述反应条件为：反应温度为35～40℃，反应时间为20～40min；

取2μli链/磁珠复合物加入到所述不同ph值的tae缓冲液中进行反应；优选的，所述反应条件为：反应温度为25～30℃，反应时间为1～2h；

将上述反应结束后的混合液进行磁分离，得到不同ph值的上清液；

对不同ph值的上清液进行荧光检测，得到不同ph值样品对应的荧光光谱图；

根据不同ph值样品荧光光谱图在530nm发射波长处的荧光强度绘制标准曲线；

(2)取待检测样品，按照步骤(1)中的方法进行荧光检测，根据标准曲线得到待检测样品的ph值。

在本发明的一个实施方式中，发夹h1链和h2链的退火，包括以下步骤：

将h1链、h2链溶液分别加热至90～95℃5～10min，随即以0.1～0.3℃/s冷却至25～30℃，并于25～30℃下继续稳定2～3h。

在本发明的一个实施方式中，所述i链/磁珠复合物的制备方法，包括以下步骤：

采用ph＝7.0的磷酸缓冲溶液洗涤羧基化磁珠，然后采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液(0.1m)活化羧基；优选的，活化条件为：反应温度为35～40℃，反应时间为20～40min；

将反应后的体系用ph＝7.0磷酸缓冲溶液进行洗涤，去除多余的edc；

将氨基化的引发链i链加入到上述磁珠分散液中进行反应，制备得到i链/磁珠复合物；优选的，所述反应条件为：反应温度为35～40℃，反应时间为10～15h。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1实验原理

实验原理如图1所示，该体系由两种发夹dna(h1和h2)、单链引发dna(i)和捕获探针(ut)组成。其中发夹h1链的5'末端和h2链的3'末端分别修饰荧光基团alexafluor488。体系中引入了羧基化的聚苯乙烯磁珠，3'末端修饰氨基的引发链i链可以通过酰胺反应连接到磁珠表面，得到i链/磁珠复合物。酸性条件下(ph＝4.0-6.0)，发夹h1链、h2链的双螺旋茎部与ut链结合，形成反hoogsteen键的三螺旋发夹结构m1、m2。加入i链/磁珠复合物后，i链无法发生toehold介导的链取代反应。磁分离后，对上清液进行荧光光谱扫描，可检测到荧光信号。

在中性及碱性条件下(ph＝7.0-9.0)，发夹h1链、h2链与ut链共存在溶液中，无法形成三螺旋结构；加入i链/磁珠复合物后，基于toehold介导的链取代反应，i链序列a*与h1链的toehold区域a互补杂交，引发链迁移过程，使h1链的发夹结构打开，裸露出c-b*序列；溶液中h2链的toehold区域c*与h1链打开后裸露的单链dna序列c互补杂交，引发链迁移过程，使h2链的发夹结构打开，裸露出a*-b*序列；h2链打开后裸露的单链dna序列a*-b*与i链的序列相同，从而引发新一轮反应，实现h1链、h2链的持续组装，在磁珠表面形成长的双链dna结构。磁分离后，对上清液进行荧光光谱扫描，仅可检测到背景荧光信号。

实施例2

一种三螺旋ph生物传感器，该生物传感器体系包括两种发夹dna(h1和h2)、单链引发dna(i)、捕获探针(ut)，h1链的序列为5'-tacagcgaggaagggagaagaggataggagtcctcttctcccttcctc-3'，h2链的序列为5'-tcctcttctcccttcctcgctgtagaggaagggagaagaggactccta-3'，i链的序列为5'-tcctcttctcccttcctcgctgta-3'，ut链的序列为5'-gaggaagggagaagagga-3'，其中，发夹h1链的5'末端和h2链的3'末端分别修饰荧光基团alexafluor488，i链的3'末端修饰氨基，体系中引入羧基化的聚苯乙烯磁珠，3'末端修饰氨基的引发链i链可以通过酰胺反应连接到磁珠表面，得到i链/磁珠复合物。

实施例3

(1)用ph＝7.0的tae缓冲液(40mmtris-base，1m冰醋酸，2mmedta-2na，15mmmgcl2)分别稀释引发链i链至2μm，稀释发夹h1链、h2链、捕获探针ut链至20μm。

(2)发夹h1链和h2链分别退火：将dna溶液加热至95℃运行5min，随即以0.1℃/s冷却至25℃，并于25℃下继续稳定2h；

(3)分别取退火后的h1链和h2链(20μm)各2μl与4μlut链(20μm)混合，并分别加入到42μlph＝4.0-9.0的tae缓冲液中，37℃下反应30min。

(4)取10μl羧基化的聚苯乙烯磁珠(～5μm，10mg/ml)(天津倍思乐色谱技术开发中心)，用200μl磷酸缓冲溶液(pbs，0.01m，ph＝7.0)利用磁悬浮作用重复洗涤三次，然后，向其中加入200μl1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液(0.1m)，在37℃的条件下，反应30min，活化羧基。

(5)用磷酸缓冲溶液(pbs，0.01m，ph＝7.0)利用磁悬浮作用重复洗涤三次，去除多余的edc。

(6)将10μl引发链i链(2μm)加入到上述磁珠分散液中，在37℃条件下，反应12h，制得i链/磁珠复合物(i链浓度为1μm)。

(7)取i链/磁珠复合物(i链浓度为1μm)2μl加入到步骤(3)所述溶液中，25℃下反应2h。

(8)反应结束后进行磁分离，得到不同ph值的上清液。

表1本发明中用到的dna序列

实施例4非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证dna在不同ph下的反应途径。如图2所示，当ph＝4.0-6.0(泳道1-3)时，由于发夹h1链和h2链的茎部与ut链形成反hoogsteen键的三螺旋发夹结构，加入i链后，无法由i链引发h1链和h2链的自组装，因此没有大分子量的产物产生。然而，当ph＝7.0-9.0(泳道4-6)时，由于发夹h1链和h2链无法与ut链形成三螺旋结构，加入i链后，h1链和h2链由i链引发一系列toehold介导的链取代反应，生成大分子量的长的双链dna产物。因此，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果验证了我们提出的不同ph值下dna不同组装方式的可行性。

实施例5荧光光谱

通过荧光光谱验证dna在不同ph下的反应途径。当ph＝4.0-6.0时，由于发夹h1链和h2链的茎部与ut链结合，形成反hoogsteen键的三螺旋发夹结构m1、m2。加入i链/磁珠复合物后，i链无法发生toehold介导的链取代反应，磁分离后，h1链和h2链共存在上清液中，因此荧光较强。

当ph＝7.0-9.0时，由于发夹h1链和h2链无法与ut链形成三螺旋结构。加入i链/磁珠复合物后，i链引发溶液中的h1链和h2链的持续组装，在磁珠表面形成长的双链dna结构。因此磁分离后，上清液仅能检测到背景荧光信号。

实施例6

一种检测ph的方法，该方法包括：

(1)制作标准曲线(如图3所示)：

1)分别用ph＝7.0的tae缓冲液稀释引发链i链至2μm、发夹h1链、h2链和捕获探针ut链至20μm；

2)发夹h1链和h2链分别退火：将含有h1链和h2链的dna溶液加热至95℃运行5min，随即以0.1℃/s冷却至25℃，并于25℃下继续稳定2h；

3)分别取退火后的h1链和h2链(20μm)各2μl与4μlut链(20μm)混合，并分别加入到42μlph＝4.0-9.0的tae缓冲液中，37℃下反应30min。

4)取10μl羧基化的聚苯乙烯磁珠，用200μl磷酸缓冲溶液(pbs，0.01m，ph＝7.0)利用磁悬浮作用重复洗涤三次，然后，向其中加入200μl1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液(0.1m)，在37℃的条件下，反应30min，活化羧基。

5)用磷酸缓冲溶液(pbs，0.01m，ph＝7.0)将体系重复洗涤三次，去除多余的edc。

6)将10μl引发链i链(2μm))加入到上述磁珠分散液中，在37℃条件下，反应12h，制得i链/磁珠复合物(1μm)。

7)取i链/磁珠复合物(1μm)2μl加入到步骤(3)所述溶液中，25℃下反应2h。

8)反应结束后进行磁分离，得到不同ph值的上清液。

9)对不同ph值的上清液进行荧光检测，得到不同ph值样品对应的荧光光谱图；

10)根据不同ph值样品的荧光光谱图在530nm发射波长处的荧光强度绘制标准曲线；

其中，各链的序列如表1所述。

(2)取待检测样品，按照步骤(1)中的方法进行荧光检测，根据标准曲线得到待检测样品的ph值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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<110>青岛大学

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