一种检测配方奶粉中脂溶性维生素含量的方法及其样品前处理方法与流程

本发明涉及食品检测领域。更具体地，涉及一种检测配方奶粉中脂溶性维生素含量的方法及其样品前处理方法。

背景技术

维生素是机体维持其正常生活所必需的一类营养素，也是婴幼儿配方奶粉中必须添加的成分。维生素的种类很多，化学结构各异，通常根据其溶解性分为脂溶性和水溶性两大类，在婴幼儿配方粉中添加的脂溶性维生素主要包括维生素a、d、e、k等。世界各国对婴幼儿配方粉中添加的维生素种类和含量有严格的规定。然而，婴儿配方粉中维生素的真实含量与实际标签值不符的情况时有发生。由于维生素摄入不足或过量均可导致机体功能障碍，因此对婴幼儿配方粉中的维生素质量进行评价是评判婴幼儿配方粉质量的重要指标。脂溶性维生素的检测方法包括反相液相色谱法、正相液相色谱法、液相色谱串联质谱法等。我国于2016年发布了gb5009.82-2016《食品中维生素a、d、e的测定》以及gb5009.158-2016《食品中维生素k1的测定》用于脂溶性维生素的检测。gb5009.82-2016《食品中维生素a、d、e的测定》共包含四个方法，分别规定了采用液相色谱法测定维生素a和维生素e、采用正相色谱法测定维生素e、采用液相色谱-串联质谱法测定维生素d以及采用高效液相色谱法测定维生素d。gb5009.158-2016《食品中维生素k1的测定》包含两个方法，第一法对维生素k1的检测需要采用锌还原柱柱后还原荧光检测器进行检测。由于受锌还原柱柱填充效果和还原效率的影响，维生素k1的检测重复性较差。第二法采用了液相色谱-质谱法进行检测。采用的前处理方法需要经过脂肪酶酶解、正己烷提取、净化等步骤。在实际检测过程中，一个婴幼儿配方奶粉样品需要采取至少两种前处理方法以及多套仪器设备才可完成维生素a、d、e、k1的测定分析。为实现多种脂溶性维生素的同时检测，张艳海等(张艳海，其布勒哈斯，金燕，王佳，马文丽,在线二维液相色谱法同时测定婴幼儿和成人配方营养品中的维生素a、d3和e.色谱,2015,33(03):291-297.)采用了在线二维液相色谱法，通过对一维色谱维生素d3进行富集，实现了在同一台仪器上同时检测维生素a、d、e。随着分析技术的发展,多种维生素联合检测已成为维生素检测技术的发展趋势。采用液相色谱-串联质谱仪器替代传统的液相色谱检测，可以实现多维生素的同时检测，且灵敏度和选择性均优于液相色谱。朱姜等(朱姜，张鹏，杨嘉，邹勇平，周元元，张林.高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中的维生素a、维生素d、维生素e.中国卫生检验杂志,2015,25(11):1733-1736.)采用高效液相色谱-串联质谱法同时测定奶粉中的维生素a、维生素d、维生素e，但未对维生素k1进行同时测定。赵孔祥等(赵孔祥，娄婷婷，何佳，陈其勇，葛宝坤，郑文杰.同位素稀释/液相色谱-串联质谱测定婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素.分析测试学报,2015,34(12):1372-1376.)采用同位素稀释/液相色谱-串联质谱(配备大气压化学电离源)同时测定婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素a、d、e和k1，但所述样品前处理过程比较复杂，样品需先经过脂肪酶酶解过夜，再进行皂化反应，石油醚提取等步骤，整个流程耗时较长。国际上，phinney等(k.wphinney.c.a.rimmer,j.b.thomas,l.c.sander,k.e.sharpless,s.a.wise,isotopedilutionliquidchromatography-massspectrometrymethodsforfat-andwater-solublevitaminsinnutritionalformulations.analyticalchemistry,2011,83(1):92-98.)也报道了采用液相色谱-质谱测定婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素a、d、e和k1的方法，定量方法为母离子定量。timplozza等(t.plozza,v.c.trenerry,d.caridi.thesimultaneousdeterminationofvitaminsa,eandβ-caroteneinbovinemilkbyhighperformanceliquidchromatography–iontrapmassspectrometry(hplc–msn),foodchemistry134(2012)559–563)报道了液相色谱-离子阱质谱测定牛乳中维生素a、d和β-胡萝卜素的方法。

目前，世界各国对于婴幼儿配方食品中营养成分的管理不断加强,对数据的准确性要求越来越高,监测范围及样本量也越来越大,这都要求配方奶粉中，尤其是婴幼儿配方奶粉中维生素检测技术进一步发展以满足其需要。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种检测婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素(维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1)含量的样品前处理方法，该方法耗时短、步骤简单，适用于同时、快速检测婴幼儿配方奶粉中维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1的含量。

本发明的另一个目的在于提供一种能够准确检测婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素含量的方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明提供了一种检测配方奶粉中脂溶性维生素含量的样品前处理方法，该方法包括以下步骤：

称取待测配方奶粉样品，加入抗坏血酸，无水乙醇以及koh溶液进行皂化；

向皂化后的溶液中加入正己烷，液液萃取后离心，收集上清液；

将上清液氮吹至干，复溶，过滤，得待测溶液。

在本发明中，所使用的术语“脂溶性维生素”是指维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1。

进一步地，根据本发明的具体实施方式，所述皂化的条件：温度为50℃-80℃，皂化时间为5min-60min。进一步地，皂化温度包括但不限于例如50℃，60℃，70℃，80℃等等。所述皂化时间包括但不限于例如5min，10min，20min，30min，50min，60min等等。根据本发明的具体实施方式，皂化温度优选为80℃，皂化时间为15min。

根据本发明的具体实施方式，所述koh溶液的质量浓度为40％-80％；所述待测配方奶粉样品与koh溶液的质量体积比g:ml为1:(2-5)。优选的，koh质量浓度为60％。koh溶液的作用一在于将维生素a和维生素e的酯化形态通过皂化反应转化为维生素a和维生素e的单体形态，作用二在于通过婴幼儿配方乳中的油脂的皂化反应，使包裹在油脂中的维生素d和维生素k1离解出来。

根据本发明的具体实施方式，所述待测配方奶粉样品与无水乙醇的质量体积比g:ml为1:(10～20)。优选的，待测配方奶粉样品与无水乙醇的质量体积比为1:10。加入无水乙醇的目的在于增加油脂在koh中的溶解度，从而加速皂化反应的进行。

根据本发明的具体实施方式，所述待测配方奶粉样品与抗坏血酸的质量比为1:(0.1-1)。优选的，待测配方奶粉样品与抗坏血酸的质量比为1:0.3。加入抗坏血酸的目的在于保护皂化反应中生成的维生素单体，避免其被氧化。

根据本发明的具体实施方式，所述待测配方奶粉样品与正己烷的质量体积比g:ml为1:(10-25)。优选的，待测配方奶粉样品与正己烷的质量体积比为1:20。

进一步地，上述方法中，优选将上清液氮吹至干，使用甲醇复溶，并经孔径为0.2μm滤膜过滤。

本发明还提供了一种检测配方奶粉中脂溶性维生素含量的方法，该方法包括以下步骤：

(1)在待测配方奶粉样品中添加维生素内标溶液，得到待处理样品；

(2)按照权利要求1-6任一所述的样品前处理方法对待处理样品进行前处理，得到待测溶液；

(3)采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用技术对步骤(2)获得的待测溶液中维生素a、维生素d2、维生素d、维生素e和维生素k1进行内标法定量检测；

进一步地，所述维生素内标为维生素a-d5、维生素d2-d3、维生素d3-d3、维生素e-d6、维生素k1-d7。

根据本发明的具体实施方式，所述超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用的检测条件为：

色谱柱：acquityuplcbehc18柱：1.7μm,2.1x100mm；

流动相：a为0.2％甲酸水溶液，b为体积比6:4的乙腈-甲醇溶液；

流速：0.25ml/min；

柱温：40℃；

进样量：5μl

洗脱方式：梯度洗脱；

其中，所述梯度洗脱程序见表1；

表1梯度洗脱程序

所述三重四级杆质谱的检测条件为：

离子源：电喷雾离子源(esi源)；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多反应监测(mrm)；

分辨率：单位分辨率；

电喷雾电压：5500.0v；

雾化气流气：50.0l/min；

气帘气流速：20.0l/min；

辅助气流速：50.0l/min；

离子源温度：500℃。

本发明所述的检测方法可以实现对配方奶粉中脂溶性维生素的定量检测，为了更清楚地说明本发明的方法，在此进一步提供一种内标法定量方法，其包括：

(1)标准曲线绘制：配制维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1系列浓度标准工作液及其内标标准工作液，通过超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用技术测定，分别以维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1色谱峰面积与其内标的色谱峰面积比为纵坐标，以维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1的质量浓度与其内标的质量浓度比为横坐标，作线性回归，得到维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1的标准曲线；

(2)根据标准曲线，通过测得的样品中维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1及其内标的色谱峰面积计算得到维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1的含量。

本发明的有益效果：

(1)本发明的样品前处理方法步骤简单，重复性好，大大简化了婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素的前处理流程，缩短了检测周期。

(2)本发明通过液相色谱-串联质谱进行脂溶性维生素的同时定量检测，实现了再同一台设备上进行多种维生素的检测，简化了脂溶性维生素的分析流程，节省了人力物力。

(3)本发明通过在样品前处理过程中加入内标化合物，随样品走完前处理和仪器分析的全过程，提高了分析结果的准确程度。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出标准品的色谱图以及实际样品测得各维生素的色谱图。

图2示出不同提取试剂对提取效率的影响。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明中所述维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1的结构式如下所示：

实施例1

1、材料与仪器

1.1材料

甲醇：色谱纯，fisherchemicalsinc.

醋酸铵：色谱纯，fisherchemicalsinc.

乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

石油醚：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

异丙醚：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

抗坏血酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

氢氧化钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

超纯水：符合gb/t6682规定的一级水。

维生素a、维生素e(α-生育酚)、维生素d2、维生素d3、维生素k1等标准品购自dr.ehrenstorfergmbh(ausburg,germany)；维生素a-d5、维生素d2-d3、维生素d3-d3维生素e-d6、维生素k1-d7等标准品购自加拿大torontoresearchchemical；

标准品均用甲醇配制成相应储备溶液，使用时用甲醇稀释成合适浓度的混合工作液。

1.2仪器与设备：

(1)超高效液相色谱仪：shimadzu高效液相色谱仪，配备高压输液泵lc-30ad、自动进样器sil-30ac、柱温箱cto-20ac；

(2)三重四极杆质谱仪：absciexqtrap6500，配备电喷雾离子源、正离子扫描模式；

(3)氮吹仪：organomationassociateinc；

(4)涡旋混合器：ikamsa3；

(5)恒温振荡器：memmert；；

(6)移液枪：10-100μl、20-200μl、100-1000μl、500-5000μl；

(7)聚丙烯离心管：50ml，具盖；

(8)低温离心机：sigma3-18k；

(9)色谱柱：acquityuplcbehc18，1.7μm,2.1x100mm；

(10)微孔滤膜：0.2μmghpmembrane；

(11)进样瓶：2ml；

(12)一次性注射器：碧迪医疗器械(上海)有限公司；

(13)超纯水机：美国millipore公司milli-q系列。

2、测定方法

2.1超高效液相色谱的检测条件为：

色谱柱：acquityuplcbehc18柱：1.7μm,2.1x100mm；

流动相：a为0.2％甲酸水溶液，b为乙腈：甲醇(6:4，v/v)；

流速：0.25ml/min；

柱温：40℃；

进样量：5μl

洗脱方式：梯度洗脱；

其中，所述梯度洗脱程序见表1。

2.2三重四级杆质谱的检测条件为：

离子源：电喷雾离子源(esi源)；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多反应监测(mrm)；

分辨率：单位分辨率；

电喷雾电压：5500.0v；

雾化气流气：50.0l/min；

气帘气流速：20.0l/min；

辅助气流速：50.0l/min；

离子源温度：500℃。

2.3三重四级杆质谱条件的优化

采用三重四级杆质谱在esi(+)模式下，分别对维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e、维生素k1、维生素a-d5、维生素d2-d3、维生素d3-d3、维生素e-d6、维生素k1-d7的标准品溶液(浓度为1μg/ml)进行一级质谱全扫描分析，以得到分子离子，然后以分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描，获得响应最高的两个子离子，再以多反应监测模式(mrm模式)对去簇电压和碰撞能量进行优化，使选定母离子和子离子组成的特征离子的丰度和比例达到最佳。需要说明的是vd3的子离子为m/z367.3和m/z259，在优化质谱条件时发现m/z367.3的响应比m/z259的响应高，但在实际样品分析过程中，m/z367.3的杂质峰干扰较大，m/z259的杂质干扰较小，因此选择m/z259为定量离子，分析结果更为准确。优化得到的质谱检测参数如下表2：

表2质谱检测参数

*：定量离子

2.4标准曲线的制备

1)针对婴幼儿配方奶粉中维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1的含量范围，配制不同浓度区间的混合维生素标准溶液，标准系列工作液的六个浓度水平见表3。

表3标准系列工作液浓度(μg/ml)

2)以上标准溶液均添加一定体积的内标溶液，使其最终浓度与待测样液中内标的浓度一致，其中，维生素d2-d3、维生素d3-d3的浓度为4ng/ml，维生素a-d5、维生素e-d6、维生素k1-d7的浓度为20ng/ml。

3)通过超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪测定得到不同浓度混合维生素标准溶液各自的色谱峰；分别以维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1色谱峰面积与其内标的色谱峰面积比为纵坐标，以维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1的质量浓度与其内标的质量浓度比为横坐标，作线性回归，得到维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1的标准曲线；

2.5样品的测定

2.5.1婴幼儿配方奶粉的测定

对婴幼儿配方奶粉样品进行测定，具体通过如下步骤进行检测：

(a)样品前处理

精密称取1.00g配方奶粉样品于50ml具盖离心管中，加入200μl浓度为1μg/ml的维生素d2-d3、维生素d3-d3混合内标溶液和100μl浓度为10μg/ml的维生素a-d5、维生素e-d6、维生素k1-d7混合内标溶液，加入0.3g抗坏血酸，和10ml无水乙醇以及2ml60％koh溶液进行皂化，充氮后立即盖盖，涡旋混匀。80℃恒温振荡器中振荡15min，之后取出离心管冷却至室温；加入20ml正己烷，置于振荡器中15min，取出后加水至50ml，振荡5min，5000r/min离心5min，取出后静置15min，将上清液全部转移至另一50ml离心管中，氮吹至干，1ml甲醇定容，涡旋使充分溶解，用2ml注射器吸取溶液并经过0.2μm微孔滤膜过滤得到样液，将样液稀释50倍，得到待测液，上机测定。

(b)采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测液中维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e、维生素k1进行内标法定量检测。

检测结果见图1。从图1可见，维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1的保留时间分别为6.7min、9.7min、9.8min、10.9min和12.3min。根据标准曲线定量，待测婴幼儿配方奶粉中维生素a的含量为433.8μg/100g，维生素e的含量为10.6mg/100g，维生素k1的含量为37.1μg/100g，维生素d3的含量为9.0μg/100g，维生素d2未检出。

实施例2标准质控奶粉样品的测定

对婴幼儿配方质控奶粉样品进行测定，具体通过如下步骤进行检测：

(a)样品前处理

精密称取1.00g配方奶粉质控样品于50ml具盖离心管中，加入200μl浓度为1μg/ml的维生素d2-d3、维生素d3-d3混合内标溶液和100μl浓度为10μg/ml的维生素a-d5、维生素e-d6、维生素k1-d7混合内标溶液，加入0.3g抗坏血酸，和10ml无水乙醇以及2ml60％koh溶液进行皂化，充氮后立即盖盖，涡旋混匀。80℃恒温振荡器中振荡15min，之后取出离心管冷却至室温；加入20ml正己烷，置于振荡器中15min，取出后加水至50ml，振荡5min，5000r/min离心5min，取出后静置15min，将上清液全部转移至另一50ml离心管中，氮吹至干，1ml甲醇定容，涡旋使充分溶解，用2ml注射器吸取溶液并经过0.2μm微孔滤膜过滤得到样液，将样液稀释50倍，得到待测液，上机测定。

(b)采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测液中维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e、维生素k1进行内标法定量检测。

定量结果为，质控奶粉中维生素a的含量为527.7μg/100g，维生素e的含量为13.24mg/100g，维生素k1的含量为88.67μg/100g，维生素d3的含量为10.84μg/100g，维生素d2未检出。与参考值对照，结果准确可靠，具体结果见表4。

表4质控奶粉实测值与参考值对照表

实施例3检测方法的验证

1、线性范围

由于婴幼儿配方奶粉中不同维生素的含量差异较大，从μg/100g到mg/100g不等，因此对仪器的检测灵敏度和线性范围要求较高。根据婴幼儿配方奶粉中各脂溶性维生素的大致浓度范围，确定标准曲线的范围。

通过实验表明，维生素a在0.5μg/ml-10μg/ml的浓度范围内，线性关系良好，曲线r²＝0.9987；维生素d2在0.002μg/ml-0.40μg/ml的浓度范围内，线性关系良好，曲线r²＝0.9969；维生素d3在0.002μg/ml-0.40μg/ml的浓度范围内，线性关系良好，曲线r²＝0.9991；维生素k1在0.05μg/ml-1.0μg/ml的浓度范围内，线性关系良好，曲线r²＝0.9966；维生素e在0.5μg/ml-10μg/ml的浓度范围内，线性关系良好，曲线r²＝0.9976。

2、最低检出限和最低定量限

以0.005μg/ml的混合标准溶液进行分析，计算信噪比，以评价方法的灵敏度。各维生素的信噪比值如表5所示，从表中可见，各维生素的信噪比均大于10，可满足分析要求。

表5方法灵敏度

3、准确度和精确度

采用脱脂奶粉作为空白基质，通过加标回收的方式考察方法的准确度和精密度。

根据配方奶粉样品的维生素a、维生素d、维生素e、维生素k1的含量范围，设定维生素a的添加水平为100，200，400μg/100g，维生素d2、d3的添加水平为5，10，20μg/100g，维生素k1添加水平为25，50，100μg/100g，维生素e添加水平为1,2,4mg/100g，每个水平重复实验6次，实验结果见表6。维生素a的平均回收率分别为99.8％，100.2％，93.0％，相对标准偏差分别为8.37％，4.14％，6.58％。维生素d2的平均回收率分别为94.5％，89.3％，98.0％，相对标准偏差分别为7.28％，6.32％，5.08％。维生素d3的平均回收率分别为104.6％，106.4％，96.7％，相对标准偏差分别为6.35％，6.47％，4.66％。维生素k1的平均回收率分别为98.4％，104.1％，109.2％，相对标准偏差分别为8.72％，3.82％，4.87％。维生素e的平均回收率分别为108.5％，107.6％，105.3％，相对标准偏差分别为7.30％，4.51％，5.05％。

表6维生素a、d、e、k1加标回收与精密度结果(n＝6)

对比例1不同提取试剂对提取效率的影响

比较了石油醚、石油醚-乙醚(1:1)、石油醚-异丙醚(3:1)、正己烷等不同提取试剂对提取效果的影响，结果见图2。从图2可以看出，以石油醚为提取试剂时，va、维生素d3和维生素k1的响应值最差，以石油醚+异丙醚(3:1)为提取试剂时，维生素d3的提取效率最好，维生素k1的提取效率一般；以石油醚+乙醚(1:1)为提取试剂时，va的响应值最高，但维生素k1的响应值较低；以正己烷为提取试剂时，四种维生素均获得较高的响应值，尤其是维生素k1的提取效率得到显著提高。同时考虑到石油醚、乙醚以及异丙醚在使用过程中对实验人员的影响较大，最终选择正己烷作为提取试剂。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。