本发明涉及一种测定尿中砷的样品前处理试剂及方法，属于原子荧光光度计法测定尿中砷的技术领域。
背景技术
尿中砷水平直接反应砷在个体水平的吸收量，它可以定量估计近期个体对砷的吸收量，是研究近期个体对砷接触最可靠的指标，也被用作主要砷接触的生物学指标。通过对不同行业个体对砷接触的量与尿中各形态砷及总砷量的关系研究显示，尿中砷水平是检测和评价职业性砷接触的重要指标；近年来我国出现了较多高砷地方性病区，高砷地区人群相当大比率的尿样含砷量较高，需要进行长期的监测，即也是作为地方性砷中毒检测和评价的主要指标之一。通过对尿中砷的测定分析是防控砷中毒的重要技术保证，那么开展尿中砷的检测工作尤显得重要。
检测尿砷的方法有很多种，如①砷斑检测法、②分光光度检测法、③催化极谱检测法、④原子吸收检测法、⑤氢化物发生-原子荧光光谱检测法(hg-afs)、⑥电感耦合等离子检测法、⑦联用技术(hplc与icp-aes、icp-ms联用，hplc与hg-afs联用)等，其中①-④种方法或存在反应干扰、精密度不高，或存在灵敏度低、溶剂毒性大，或存在操作繁琐、时间长、污染大，或存在最低检测限较高、设备昂贵等缺陷，⑥、⑦虽然作为能够进行化学形态等分析的最新发展方法，但同样具有设备价格昂贵、一般实验室不具备、经济性和实用性较低的缺陷。因此，对于现有广泛采用和推广的尿中砷检测方法，应具备经济性、适用性、准确性等几大因素，而现行我国订立的最新卫生行业标准为ws/t474－2015《尿中砷的测定氢化物发生原子荧光法》，其采用hg-afs，也很好的印证了这一点。
ws/t474－2015标准适用于地方性砷中毒病区划分和防治效果判定，最低检测限为0.5μg/l，测定范围为0-40μg/l。但此法在操作过程中，存在样本前处理取样量大、酸用量多、使用器材多、操作繁琐、产生酸雾多易造成环境污染等缺点。肖军涛在《用afs-230e型原子荧光光度计测定尿中的砷》(以下简称文献1)(世界最新医药信息文摘2016,16(4))一文中公开了用afs-230e型原子荧光光度计，采用湿法消化-hg-afs对尿中砷进行测定,尿样经硝酸-高氯酸消化后，在酸性的条件下加入硫脲-抗坏血酸溶液将5价砷还原为3价砷，在硼氢化钾作用下生成氢化物，由氩气带入石英原子化器中分解为原子态砷，在砷空心阴极灯的发射光激发下产生原子荧光，其荧光强度在固定条件下与被测样品中的砷浓度成正比，与标准系列比较定量。该方法与ws/t474－2015标准方法相比，简化了样品处理步骤，调整了标准曲线制备过程中砷标准使用液的加入量，并对仪器操作条件进行部分调整，进一步优化hg-afs的检测方法。结果显示该方法最低检测浓度为0.076μg/l，测定的范围0-40μg/l，相对标准偏差均在3.86％以下，加标回收率为90％-102％。该方法仍存在样品前处理试剂用量多、繁琐，且在消化时易蒸发干，影响结果的准确性以及前处理好的样品需要转移等缺陷。
因此，优化现有ws/t474－2015《尿中砷的测定氢化物发生原子荧光法》方法，是对尿中砷测定技术的进一步提升，是拓宽检测范围、简化前处理、降低成本、缩短操作时间的一种新技术，是为不同行业个体对砷接触的量及病区人群尿中砷提供快速、经济、实用的尿砷检测方法，是本领域工作者致力于研究的主要方向之一。
技术实现要素：
本研究人员通过在长期开展地方性砷中毒的防治研究工作中，对尿中砷检测方法进行了长期研究，现有的测定技术污染大、步骤繁琐、需要在高温下进行，耗时较长。
为解决以上技术问题，本发明提供一种测定尿中砷过程中的样品前处理消化液，消化液包含第一消化液和第二消化液，其中，第一消化液包含双氧水和碱金属氢氧化物。第二消化液为硝酸，浓度优选为68％。
本发明还提供一种样品前处理消化液在测定尿中砷过程中的应用，其中，第一消化液包含双氧水和碱金属氢氧化物。第二消化液为硝酸，浓度优选为68％。
本发明还提供一种测定尿中砷过程中的样品前处理方法，其中，在尿样中，加入第一消化液，在100℃下消化，第一消化液为双氧水和碱金属氢氧化物的混合物。
本发明还提供一种测定尿砷的方法，包括以下步骤：
1)样品前处理：取1.0ml尿样放入10.0ml硬质消化管中，加入第一消化液1.0ml，混匀，然后将硬质消化管置于温度为100℃的消化仪上消化5～10分钟，相同温度下，加入第二消化液68％的硝酸0.5ml，消化5-20分钟，至体积约为0.6ml；
2)标准曲线的制备：取6支10.0ml硬质消化管，分别加入0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、1.00ml浓度为0.1μg/l的砷标准工作液，然后各加入1.0ml正常人混合尿液，再加入第一消化液1.0ml，混匀，置于温度为100℃的消化仪上消化5～10分钟，相同温度下，加入第二消化液硝酸0.5ml，消化5-20分钟，至体积约为0.6ml，溶液呈无色或淡黄色，冷却后分别加5％硫脲-5％抗坏血酸混合溶液1.0ml，2.0ml盐酸(18％)，然后用超纯水在硬质消化管中定容至10.0ml刻度位置，配制成砷浓度分别为0.00、10.0、30.0、50.0、70.0、100.0μg/l系列砷标准溶液，混匀，静置20-30分钟，取1.0ml进样量，上配置砷空心阴极灯及配套分析软件的afs-230e双道原子荧光光度计，测定标准系列，绘制标准曲线；
3)样品测定：以5％盐酸为载流，2％硼氢化钾为还原剂，氩气为载气；在步骤2)消化好的尿样中加入2.0ml盐酸(18％)，5％硫脲-5％抗坏血酸混合溶液1.0ml，加超纯水至10.0ml，充分混匀，静置20-30分钟，取1.0ml进样量，上配置砷空心阴极灯及配套分析软件的afs-230e双道原子荧光光度计进行测定；
其中，第一消化液为过氧化氢(30％)、氢氧化钠(4％)按1:(1.5)体积进行混合的混合液。第二消化液为硝酸，浓度优选为68％。
所用溶剂的单位百分比均为质量百分比。
此方法具有操作简便、稳定性好、灵敏度高、干扰少、线性范围宽、样品前处理简单、时间短、成本低、环境污染小等特点。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚的了解本发明方法，申请人在具体实施例中以证明实验的方式做进一步的描述。
1.实验部分
1.1原理
尿样经湿法消化后，在酸性介质中，加入抗坏血酸-硫脲混合液使五价砷还原成三价砷，再以硼氢化钾作还原剂，生成砷化氢，由氩气载入石英原子化器中分解为原子态砷，在特制砷空心阴极灯的发射光激发下产生原子荧光，其荧光强度在固定条件下与被测液中的砷浓度成正比，与标准系列比较定量。
1.2仪器与试剂
1.2.1仪器：afs-230e双道原子荧光光度计，砷空心阴极灯及配套分析软件(北京瑞利分析仪器公司)，ade-di多孔自控电热消解仪(北京薄瑞赛科有限责任公司)，10.0ml具塞刻度磨口硬质玻璃消化管，百分之一电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)
1.2.2试剂：
5％盐酸，30％过氧化氢，4％naoh，68％硝酸，18％盐酸等，以上试剂均为优级纯(gr)；
2％硼氢化钾(内含0.5％氢氧化钠或0.2％氢氧化钾)，5％硫脲-5％抗坏血酸混合溶液，试剂为分析纯(ar)；
砷标准应用液(浓度1.0μg/ml)：取砷标准液(浓度为100.0μg/l，购于国家标准物质中心，标准号gsb04－1714－2004)，逐级配制至浓度为1.0μg/ml的应用液；
实验用水为≥18.2μω.cm@25℃的超纯水；
载气为＞99.99﹪高纯氩气；
试验使用尿液：用正常人尿液混合成。
1.3仪器工作条件:见表1。
表1仪器工作条件表
1.4数据和结果分析
采用excel和spss10.0进行相关数据处理和统计分析。
2.结果
2.1载流-盐酸度浓度的选择
在其它条件一定的情况下，改变载流盐酸的浓度(在2％～20％范围内)测定相应的荧光强度，当盐酸的体积分数为5％时，荧光强度最高，即灵敏度最高，因此选择盐酸的体积分数为5％。
2.2硼氢化钾的浓度
试验中发现，硼氢化钾的浓度对测定结果有较大影响。我们使用内控样浓度为25.0μg/l(gsbz5004-88环境标准批号：201732)作为比对，当硼氢化钾溶液浓度为30μg/l时，荧光强度最好，其次是浓度为20μg/l。考虑到试剂用量的经济性，故选用浓度为20μg/l，即2％。特别注意，硼氢化钾稳定性较差，溶解时需加入浓度为2g/l(0.2％)氢氧化钾或5g/l(0.5％)氢氧化钠，以保证溶液的稳定性。
2.3干扰试验
从实验室检测分析中，研究人员发现碱金属和碱土金属类共存物不干扰测定，如测定20μg/l的砷时，600倍的fe3+，ni2+，al3+，mn2+，v5+，cr6+，sn4，200倍的se4+，te4+，cu2+，pb2+，bi3+，ge4+均不干扰砷的测定。即加入这些离子后，测定的荧光值与不加的相比较，荧光强度值的改变均小于10％，同时硫脲和抗坏血酸混合溶液不仅能将(ⅴ)价砷还原成(ⅲ)价，而且具有抗干扰隐蔽剂作用。另外使用尿样加标制备的标准曲线也足以消除可能存在的干扰，一般尿样中的干扰元素的含量均未达到干扰水平。
2.4标准曲线与线性范围
取6支10.0ml具塞磨口的硬质玻璃消化管，分别加入0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、1.00ml砷标准工作液(0.10μg/l)，后各加入1.0ml正常人混合尿溶液，加30％过氧化氢、4％的naoh按1:(1.5)体积(第一消化液)进行混合的混合液1ml，置于100℃的ade-dl自控电热消化仪上消化5～10分钟，相同温度下，加入第二消化液68％硝酸0.5ml，消化5-20分钟，至体积约为0.6ml，溶液呈无色或淡黄色。冷却后分别加5％硫脲-5％抗坏血酸混合溶液1.0ml，盐酸(18％)1.0ml，然后用超纯水定容至10.0ml，配制成砷浓度分别为0.0、10.0、30.0、50.0、70.0、100.0μg/l系列砷标准溶液，混匀，静置20～30分钟，取1.0ml上机测定。以砷浓度c为横坐标，以荧光强度if为纵坐标进行线性回归，得线性方程为if＝79.192*c+100.843,相关系数γ＝0.9999。
2.5检出限
在仪器表1工作条件下，对含量恒定的〔ρ(as)〕＝10.0μg/l标准液进行11次评价测定，计算得测定结果的标准偏差rsd＝1.95％，以3倍的标准偏差除以斜率，求得检出限为0.07μg/l。
2.6精密度与准确度试验
2.6.1精密度：分别配制10.0、50.0、100.0μg/l3种不同浓度的砷标准溶液，每个浓度测定11次，结果相对标准偏差(rsd)分别为1.84％、2.06％、2.11％，符合《生物材料分析方法研准则》的要求；而文献1的精密度为2.21％(资料中获得)，标准wt/t474-2015中精密度为2.5％-4.9％(资料中获得)，说明本法比文献1及标准wt/t474-2015精密度高。
本方法与现行标准ws/t474-2015及文献1对同一尿样进行6次平行测定的分析比较，见表2。
表2三种方法对同一尿样测定的对比分析
由表2可知本发明方法测定均值与现行标准ws/t474-2015方法及文献1均在标准偏差范围内，且相对标准偏差均小于10％，说明分析过程有较高的精密度和准确度。另一方面，现行标准ws/t474-2015的相对标准偏差为4.7％，文献1的相对标准偏差4.0％，而本发明方法的相对标准偏差为1.9％，再次证明本发明方法比标准ws/t474-2015及文献1的精密度高。再将本发明数据与现行标准ws/t474-2015数据分别进行grubbs检验(gb/t4883-2008《数据的统计处理和分析正态样本离群值的判断和处理》及gb/t4882-2001《数据的统计处理和解释正态性检验》)，均无异常数据。同时这将两组数据进行f双边检验，给定α＝0.05，查f表得临界值为：f0.025(5.5)＝7.15，根据表2本发明与现行标准的两组数据计算f值，f＝s2max/s2min＝0.122/0.052＝5.76，结果，f〈f0.025(5.5),得到两种方法的精密度无显著性差异。对两组数据进行t检验，计算统计量t＝0.816，当α＝0.05，自由度f＝10时，查表得t0.05(10)＝2.228，t〈t0.05(10)，说明现行标准ws/t474-2015与本发明方法的测定结果无显著性差异，即本新方法准确可靠。
2.6.2准确度：新方法取正常人混合尿液加入高中低不同浓度的砷标准溶液进行测定。结果测定值在标准偏差范围内，回收率在97.2％～104.6％之间，符合《职业卫生标准制定指南第5部分：生物材料中化学物质的测定方法》(gb/t210.5-2008)要求，说明准确度高。具体见表3。
表3准确度试验
2.7稳定性试验：取尿样48份，各加入浓度为10.0μg/l的砷标准应用溶液。第1天测定6份，其余的放在4℃下保存，然后分别在第2、4、6、8、10、12、14天各测定6份。结果表明，样品在4℃下至少可保存2周。
2.8样品测定
2.8.1样品前处理：取1.0ml尿样于10.0ml具塞刻度磨口硬质玻璃消化管中，加30％过氧化氢、4％的naoh按1:(1.5)体积进行混合的混合液1ml(第一消化液)，置于100℃的ade-dl自控电热消化仪上消化5-10分钟，相同温度下，加入第二消化液68％的硝酸0.5ml，消化5-20分钟，至体积约为0.6ml，此时溶液呈无色或淡黄色。若颜色较深，取出冷却，然后补加0.5ml过氧化氢，再加热分解，直至管壁内无回流现象，液面平静，同时看到消化管中液体呈无色透明状态，消化结束(即样品前处理完成)，然后取下放冷却至常温。同时作3个空白实验。
2.8.2测定：以5％盐酸为载流，2％硼氢化钾为还原剂，氩气为载气。把消化好的尿样加入2.0ml18％盐酸，5％硫脲-5％抗坏血酸溶液1.0ml，加超纯水至10.0ml，充分混匀，静置20-30分钟，开机待测；测定之前仪器先预热20min，在测定试剂空白。在获得稳定的试剂空白荧光强度后，再依次测标准系列，仪器自动扣除空白，绘出标准曲线，算出回归方程和相关系数，最后测定样品。但测定样品之前，仪器需再测定一次试剂空白和样品空白，才测定样品，样品进样量为1.0ml。仪器根据已给的参数自动计算出结果。测定完毕，立即清洗仪器。
2.9计算
2.9.1按式(1)把尿样换算成标准比重(1.020)下的浓度校正系数k。
2.9.2计算尿中砷的浓度，x＝c*k……(2)
式中：x，是尿中砷浓度(mg/l)；k由标准曲线查得的砷浓度(mg/l)。
3.结论
以上结果显示，本发明的消化液与常规消化液相比，组成简单，可以在低温下快速消化，比其它的样品前处理方法更为简便、缩短了消化时间。和现行标准方法对比，本方法的最低检测为0.07μg/l，精密度1.9﹪(n＝6)，加标回收率在97.2％～104.6％之间，相对标准偏差﹤10﹪，样品在4℃下至少可保持2w，说明砷含量与高砷环境条件相符，方法稳定性高，实用性强。本方法适用于大批量尿样中砷的测定和尿样中低砷、适砷和高砷的测定，相对于其它方法具有精密度高、灵敏度好、准确可靠、简便快捷、干扰少、线性范围宽、实用性强、成本低等优点，在尿砷的测定分析中，值得推广和应用。