本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种虾血细胞虹彩病毒的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
自1954年xeros在沼泽大蚊(tiphoneulapaludosa)中发现首例虹彩病毒以来，人们已经陆续从两栖类、甲壳类、鱼类和爬行类中发现虹彩病毒。根据国际病毒分类委员会第九次报告，虹彩病毒科(iridoviridae)下设五个属：即虹彩病毒属(iridovirus)，绿虹彩病毒属(chloriridovirus)，蛙病毒属(ranavirus)，淋巴囊肿病毒属(lymphocystivirus)和细胞肿大病毒属(megalocytivirus)，其中后面三个属的虹彩病毒可以感染鱼类。
虹彩病毒病是一种广泛存在于水生动物且危害较大的病毒性疾病。目前，虹彩病毒成为一些鱼类、两栖类动物的新型病原体，特别是水产养殖业中的经济类品种再加上其特殊的生物学特性，因此越发引起人们的关注和重视。
对虾感染虹彩病毒，最早于1993年lightner和redman在靠近厄瓜多尔对虾养殖场发现了被虹彩病毒感染的原糙对虾(protrachypeneprecipuaburkenroad)。这是首次报道十足目动物能够感染虹彩病毒。对感染虹彩病毒的原糙对虾组织病理学观察发现，表皮上皮细胞(鳃、胃内层甚至遍布全身)呈现典型的虹彩病毒的感染；造血组织，触角腺上皮组织，以及心脏、肌肉、皮下组织、鳃、肝胰腺中的结缔组织细胞和吞噬细胞也被虹彩病毒感染。
2017年，中科院黄海研究所科研人员在浙江严重死亡的南美白对虾上发现一种新病毒，相关研究报道称新分离的病毒属于虹彩病毒科，但不属于虹彩病毒科下已建立的五个属，感染该病毒的虾造血组织、鳃丝、肝胰腺、附肢和肌肉的血细胞中出现嗜碱性包涵体和核固缩现象，因此命名为虾血细胞虹彩病毒(shiv)。该病毒与2014年国家海洋局第三海洋研究所的科研人员从红螯螯虾中分离的红螯螯虾虹彩病毒(cqiv)的基因序列一致，属于同一种病毒的不同分离株。
对于虾血细胞虹彩病毒，我们的了解不是很多，也还没有正式的文献报道，虾感染shiv后出现的主要症状与感染红螯螯虾虹彩病毒(cqiv)、樱花虹彩病毒(siv)、虾白斑综合症病毒(wssv)等极为相似，为快速准确检测出虾血细胞虹彩病毒，可以通过抗原与抗体的特异性结合，根据循环外周血中虾血细胞虹彩病毒的抗体的数量，可判断是否感染虾血细胞虹彩病毒，用于虾血细胞虹彩病毒感染的辅助诊断，可以快速、敏感的检测出对虾的感染情况。目前还没有比较有效的专门针对虾血细胞虹彩病毒的精确检测手段。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种虾血细胞虹彩病毒的检测试剂盒及其检测方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。
为了实现上述目的，本发明提供一种虾血细胞虹彩病毒的检测试剂盒，其包括氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽，分别为：
seqidno.1：gluglyalaglualaalavalleuleualaalaalaglyileglnglyserthrala；
seqidno.2：glngluleugluserglualaglyglyileargvalthralaseralaargthrgly；
seqidno.3：thrmetglyalaglyilegluargarggluthralaalaproalathralathrgly；
seqidno.4：glualametaspleuleuserglualaglualathrilealaserthrglyglyala；
seqidno.5：leuthrilevalglygluglyserleulysalaglyalaalathralaileglyglu；
seqidno.6：alailegluglyaspseralathrglyleuglualaalametseralaileglyala。
本发明中，氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽在试剂盒中作为tb刺激物，用于检测反应。
优选地，在所述虾血细胞虹彩病毒的检测试剂盒中，氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽中的每一条的含量为10mg。
优选地，所述虾血细胞虹彩病毒的检测试剂盒还包括无血清培养基。
优选地，所述虾血细胞虹彩病毒的检测试剂盒还包括分离液。
优选地，所述虾血细胞虹彩病毒的检测试剂盒还包括高特异性鼠抗人igg抗体和/或虾血细胞虹彩病毒感染阳性刺激物。
优选地，所述虾血细胞虹彩病毒的检测试剂盒还包括用于酶联免疫斑点法的显色试剂，如nbt/bcip显色系统，最终显色蓝紫色斑点，或aec显色系统，最终显色红色斑点。
本发明还提供利用前述虾血细胞虹彩病毒的检测试剂盒对虾血细胞虹彩病毒进行检测的方法，包括如下步骤：
(1)用分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；
(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列如进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人igg抗体进行抗原抗体反应；
(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。
步骤(1)中，所述将分离好的细胞重悬于无血清培养基中优选保持细胞浓度为1.0×105～3.0×105细胞/ml。
步骤(2)中，所述重悬后的细胞优选加入96孔板中，所述加入氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽优选加入96孔板中与重悬后的细胞混合以进行共孵育。所述重悬后的细胞的添加量更优选每个反应孔为100μl，所述氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽的添加量优选每个反应孔中的终浓度为5μl。所述共孵育的时间优选16～20小时。
如本领域常规，步骤(2)在操作时，优选设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为虾血细胞虹彩病毒阳性刺激物；所述阴性对照为无血清培养基留白，即反应孔中只添加无血清培养基，不添加任何其他试剂。
本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明除特别说明之外，所用的百分比都是体积百分比。
本发明的有益效果为：本发明提供的包括氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽的检测试剂盒能够人工全序列合成，生产方便快捷，稳定性和特异性高，且相比传统方法检测的过程大大简化，极大地降低了成本。利用该试剂盒对分离的体外样本进行检测方便快捷，可控性和精确性均非常理想，且试剂盒操作简便。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。
本发明基于虾血细胞虹彩病毒的免疫应答机制，设计出能够人工全序列合成的6条多肽作为检测物(即序列表中的多肽1～多肽6，氨基酸编码序列对应为seqidno.1～seqidno.6)，经过大量的实验验证，并经和现有的检测方法对比，具有明显优势，本发明的包括氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽的试剂盒及利用其对体外虾血细胞虹彩病毒感染待测样本进行检测的方法具有方便快捷、准确度高、成本低等优势，具有良好的应用前景。
氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6的6条多肽，具体分别为：
seqidno.1：gluglyalaglualaalavalleuleualaalaalaglyileglnglyserthrala；
seqidno.2：glngluleugluserglualaglyglyileargvalthralaseralaargthrgly；
seqidno.3：thrmetglyalaglyilegluargarggluthralaalaproalathralathrgly；
seqidno.4：glualametaspleuleuserglualaglualathrilealaserthrglyglyala；
seqidno.5：leuthrilevalglygluglyserleulysalaglyalaalathralaileglyglu；
seqidno.6：alailegluglyaspseralathrglyleuglualaalametseralaileglyala。
下面是具体的实施例，用于进一步阐述本发明的技术方案及技术效果。
实施例1
马外周血样本来源于虾血细胞虹彩病毒感染性家马及非感染家马，数量为127个待测样本。
每个采样个体用肝素钠收集管采集10ml血液，室温条件下6小时内运至实验室。
各待测样本的检测步骤如下：
(1)用分离液将pbmc分离，分离好的细胞重悬于无血清培养基中，细胞浓度为1.5×105细胞/ml；将重悬的细胞加入pvdf96孔板中，每个反应孔加入100μl，每个样品加入10孔中，即做10个重复；
(2)向各反应孔中加入由无血清培养基和终浓度分别达到5μm的6条多肽组成的混合物50μl，混合均匀进行共孵育；设置阳性对照和阴性对照，向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人igg抗体进行抗原抗体反应；
(3)6％二氧化碳培养箱36℃孵育16小时；
(4)对抗原抗体反应后的体系用pbs缓冲液进行洗涤；
(5)再加入显色底物进行显色反应，室温孵育25分钟，孵育过程中观察斑点形成，计数反应生成的斑点数。
使用斑点分析仪计数斑点形成细胞的数量，根据阴性和阳性判定标准的判定，分别统计检测阴性和阳性例数，如下表所示。
阳性符合率：73/(73+6)＝92.41％
阴性符合率：44/(44+4)＝91.67％
实施例2
马外周血样本来源于虾血细胞虹彩病毒感染性家马及非感染家马，数量为127个待测样本。
每个采样个体用肝素钠收集管采集10ml血液，室温条件下6小时内运至实验室。
各待测样本的检测步骤如下：
(1)用分离液将pbmc分离，分离好的细胞重悬于无血清培养基中，细胞浓度为3.5×105细胞/ml；将重悬的细胞加入pvdf96孔板中，每个反应孔加入100μl，每个样品加入10孔中，即做10个重复；
(2)向各反应孔中加入由无血清培养基和终浓度分别达到5μm的6条多肽组成的混合物50μl，混合均匀进行共孵育；设置阳性对照和阴性对照，向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人igg抗体进行抗原抗体反应；
(3)5％二氧化碳培养箱36℃孵育20小时；
(4)对抗原抗体反应后的体系用pbs缓冲液进行洗涤；
(5)再加入显色底物进行显色反应，室温孵育30分钟，孵育过程中观察斑点形成，计数反应生成的斑点数。
使用斑点分析仪计数斑点形成细胞的数量，根据阴性和阳性判定标准的判定，分别统计检测阴性和阳性例数，如下表所示。
阳性符合率：75/(75+5)＝93.75％
阴性符合率：43/(43+4)＝91.49％
实验结果表面，与现有使用相同方法的产品相比较，有相类似的灵敏度及特异性，可以作为一种虾血细胞虹彩病毒检测试剂盒使用，且成本低廉，操作简单。
综上所述，本发明的多肽混合物、检测试剂盒及其相应的检测方法用于检测虾血细胞虹彩病毒，具有方便快捷、稳定性高、特异性强的特点，且极大地降低了成本。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110>李梅秀
<120>一种虾血细胞虹彩病毒的检测试剂盒及其检测方法
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gluglyalaglualaalavalleuleualaalaalaglyileglngly
151015
serthrala
<210>2
<211>19
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
glngluleugluserglualaglyglyileargvalthralaserala
151015
argthrgly
<210>3
<211>19
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
thrmetglyalaglyilegluargarggluthralaalaproalathr
151015
alathrgly
<210>4
<211>19
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
glualametaspleuleuserglualaglualathrilealaserthr
151015
glyglyala
<210>5
<211>19
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
leuthrilevalglygluglyserleulysalaglyalaalathrala
151015
ileglyglu
<210>6
<211>19
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
alailegluglyaspseralathrglyleuglualaalametserala
151015
ileglyala