一种基于骨架蛋白的降解评价鱼肉新鲜度的方法与流程

本发明属于鱼肉新鲜度评价技术领域，具体涉及一种基于骨架蛋白的降解评价鱼肉新鲜度的方法。

背景技术：

淡水鱼是我国最为丰富的水产资源，富含维生素和矿物质，具有较高含量的蛋白质及不饱和脂肪酸，是人类重要的食物来源。随着人们生活水平的提高，对鱼肉新鲜度及安全性要求也越来越高。

影响鱼肉新鲜度的因素很多，主要涉及到：加工方法、贮藏温度、微生物及自身物理化学变化。目前测评鱼肉新鲜度的方法有感官评价和k值评价。例如，专利cn102297930a一种识别与预测肉新鲜度的方法采用感官评价测定了肉类的新鲜度；cn101358958a带鱼的货架期预测模型采用高效液相色谱法测定鱼肉中三磷酸腺苷降解的产物浓度，然后计算出k值的大小。然而，感官评价受主观因素影响较大，且无法实现工业化大批量产品的快速检测；采用三磷酸腺苷降解产物的高效液相色谱法取样量较大，且检测方法繁琐。因此，发明一种取样量少、步骤快捷、对新鲜程度评价更为精细、适合工业化大批量产品在线检测的鱼肉新鲜度评价新型方法具有重要的现实意义和实用价值。

技术实现要素：

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，本发明其中的克服现有技术中存在的不足，提供一种基于骨架蛋白的降解评价鱼肉新鲜度的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种基于骨架蛋白的降解评价鱼肉新鲜度的方法，其包括，

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定不同贮藏天数下鱼肉样本的骨架蛋白的光密度值iod；

采用高效液相色谱法测定贮藏不同天数下鱼肉样本的三磷酸腺苷(atp)降解产物浓度，计算出新鲜度指标k值；

结合所述光密度值iod和所述k值，利用最小二乘支持向量机，建立鱼肉新鲜度指标k值的预测模型。

作为本发明所述的基于骨架蛋白的降解评价鱼肉新鲜度的方法的一种优选方案：所述三磷酸腺苷降解产物为二磷酸腺苷、一磷酸腺苷、肌苷酸、次黄嘌呤、次黄嘌呤腺苷。

作为本发明所述的基于骨架蛋白的降解评价鱼肉新鲜度的方法的一种优选方案：所述骨架蛋白为伴肌动蛋白、伴肌球蛋白和肌钙蛋白t。

作为本发明所述的基于骨架蛋白的降解评价鱼肉新鲜度的方法的一种优选方案：所述计算出新鲜度指标k值，其中，k值的计算公式为：

其中，

atp代表三磷酸腺苷浓度，adp代表二磷酸腺苷浓度、amp代表一磷酸腺苷浓度、imp代表肌苷酸浓度、hx代表次黄嘌呤浓度、hxr代表次黄嘌呤腺苷浓度。

作为本发明所述的基于骨架蛋白的降解评价鱼肉新鲜度的方法的一种优选方案：所述鱼肉新鲜度指标k值的预测模型方程式为：

yk＝c0+ax+by+cz

其中，yk为新鲜度指标k值；x、y、z分别代表伴肌动蛋白、伴肌球蛋白、肌钙蛋白t的光密度值；c0、a、b、c均为常数。

作为本发明所述的基于骨架蛋白的降解评价鱼肉新鲜度的方法的一种优选方案：所述鱼肉新鲜度指标k值的预测模型方程式的预测方根误差rmsep＜0.025，预测决定系数r²＞0.9。

作为本发明所述的基于骨架蛋白的降解评价鱼肉新鲜度的方法的一种优选方案：所述聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中，电泳缓冲液为，125mmol/ltris-hcl(ph6.8)，2.4％sds，50mmol/ldtt，10％甘油，0.5mmol/ledta。采用4％浓缩胶和10％分离胶进行sds-page电泳分析，电泳起始电压为90v，待样品进入分离胶后改为120v。

本发明的有益效果：本发明采用伴肌球蛋白，伴肌动蛋白、肌钙蛋白t三种骨架蛋白的降解程度表征鱼肉新鲜度，取样量少，对检测样本破坏少；无需结合其他化学指标，对生态环境破坏小；检测步骤简洁，节约检测时间，可实现在线实时监测；本发明检测水平达分子级别，准确度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为实施例1利用高效液相色谱法测定鱼肉样本在冷藏过程中atp的降解产物浓度，计算出k值图。

图2为实施例1冰藏保鲜草鱼块的伴肌球蛋白的凝胶电泳图(a)及光密度分析(b)，图中不同字母表示组内差异性显著。

图3为实施例1冰藏保鲜草鱼块的伴肌动蛋白的凝胶电泳图(a)及光密度分析(b)，图中不同字母表示组内差异性显著。

图4为实施例1冰藏保鲜草鱼块的肌钙蛋白t的凝胶电泳图(a)及光密度分析(b)，图中不同字母表示组内差异性显著。

图5为本发明基于骨架蛋白的降解测定鱼肉新鲜度指标k值的工艺流程框架图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1：

草鱼7尾，2017年5月中旬购于无锡市滨湖区华润万家超市，草鱼鱼体重(5±0.5)kg，体质健康，规格整齐。将草鱼剖杀，去头和内脏，用预冷的自来水冲洗干净，取背部白色肌肉，切成2cm×2cm×2cm块状，并随机放置于多聚乙烯袋中，封口。将包装好的草鱼块样品放入装有碎冰的塑料泡沫箱，并将其放入4℃冰箱中。在贮藏过程中，定时更换碎冰，确保贮藏温度在0±0.5℃范围内。分别在0，1，3，7，10，14，21d时取样，对冰藏过程中鱼肉骨架蛋白(伴肌球蛋白、伴肌动蛋白、肌钙蛋白t)的降解进行测定分析，对冰藏过程中鱼肉k值进行测定分析；

对冰藏过程中鱼肉骨架蛋白(伴肌球蛋白、伴肌动蛋白和肌钙蛋白t)的降解进行测定，获取其凝胶电泳图，并分析、校正、去噪处理。具体过程如下：肌原纤维蛋白电泳样品制备：将随机取样的0，1，3，7，10，14，21d鱼肉样本肌原纤维蛋白与等体积的缓冲液(1％sds，100mmol/ldtt的60mmol/ltris-hcl)混合，沸水浴2min，于4℃20000×g下离心15min。上清液与上样缓冲液(125mmol/ltris-hcl(ph6.8)，2.4％sds，50mmol/ldtt，10％甘油，0.5mmol/ledta)按1:1(v/v)混合，沸水浴5min，-20℃冷冻保存。伴肌动蛋白和伴肌球蛋白大分子蛋白采用胶的浓度为5％的连续变性电泳，肌钙蛋白t即采用5％浓缩胶和10％分离胶进行sds-page电泳分析，电泳起始电压为90v，待样品进入分离胶后改为120v。染色剂为考马斯亮蓝r-250，脱色液由10％醋酸，40％乙醇和50％水组成。跑胶2h后，取出肌钙蛋白t，跑胶15h后取出伴肌动蛋白和伴肌球蛋白凝胶，肌钙蛋白t、伴肌动蛋白、伴肌球蛋白凝胶进行染色2h，脱色2h；然后进行蛋白凝胶成像系统拍照，形成胶片；

利用sct3048-2014鱼类鲜度指标k值的测定高效液相色谱法测定鱼肉样本在冰藏过程中atp的降解产物浓度，计算出k值，如图1所示。

对120张骨架蛋白的凝胶电泳图进行分析，得出其每个时间段不同骨架蛋白相应的iod均值。具体操作为：使用image-proplus软件选中每一个目的蛋白条带和背景，由软件自动计算出各条带的灰度值。实验结果如图2～5。

由相应的骨架蛋白相应的iod均值和对应的k值，利用最小二乘支持向量机建立预测模型：yk＝c0+ax+by+cz

其中，yk为新鲜度指标k值；x、y、z分别代表伴肌动蛋白、伴肌球蛋白、肌钙蛋白t的iod值；c0、a、b、c均为常数；

将各个条带iod值分别带入公式求得：

当k≤10％时，新鲜度为一级甲等，c0＝-8.9*10⁶，a＝54.21,b＝81.11，c＝210.39；

当10％＜k≤20％时，新鲜度为一级乙等，c0＝-7.3*10⁶，a＝62.45,b＝77.51，c＝197.62；

当20％＜k≤40％时，新鲜度为二级甲等，c0＝-5.5*10⁶，a＝43.55,b＝68.41，c＝186.21；

当40％＜k≤60％时，新鲜度为二级乙等，c0＝-3.4*10⁶，a＝62.45,b＝77.51，c＝197.62；

当60％＜k≤80％时，新鲜度为三级甲等，c0＝-1.9*10⁶，a＝59.25,b＝78.97，c＝142.35；

当k＞80％时，新鲜度为三级乙等，c0＝-5.2*10⁵，a＝88.35,b＝93.15，c＝216.22；

本实例中所建立的模型预测均方根差为2.1％。

利用本发明上述鱼肉新鲜度指标k值的预测模型预测待测样品的k值。具体方法如下：

取待测冰藏5天草鱼肉样品，测定各骨架蛋白灰度值iod值，分别代入上述各个公式，发现只有当20＜k≤40％时，k为正值，且k＝36.12％，其余公式求得k为负数。故本实例中预测得到冰藏5天的草鱼肉样本的k值为36.21％，处于二级甲等鲜度等级；利用国标sct3048-2014鱼类鲜度指标k值的测定高效液相色谱法测得冰藏5天的草鱼k值为41.33％，处于二级鲜度等级；相对误差为0.08％。由此可见，骨架蛋白降解预测模型可以准确预测鲜度等级，而且评定等级更加细化。

实施例2：

草鱼5尾，草鱼鱼体重(3±0.5)kg，体质健康，规格整齐。将草鱼剖杀，去头和内脏，用预冷的自来水冲洗干净，取背部白色肉，切成3cm×3cm×3cm块状，并随机放置于多聚乙烯袋中，封口。将包装好的草鱼块样品放入4℃冰箱中。分别在1，3，9d时随机取样20个；

对冷藏过程中鱼肉骨架蛋白(伴肌球蛋白、伴肌动蛋白和肌钙蛋白t)的降解进行测定，获取其凝胶电泳图，并分析、校正、去噪处理；

利用高效液相色谱法测定鱼肉样本在冷藏过程中atp的降解产物浓度，计算出k值；

对180张骨架蛋白的凝胶电泳图进行分析，得出其每个时间段不同骨架蛋白相应的iod均值；

由相应的骨架蛋白相应的iod均值和对应的k值，利用最小二乘支持向量机建立预测模型：yk＝c0+ax+by+cz

其中，yk为新鲜度指标k值；x、y、z分别代表伴肌动蛋白、伴肌球蛋白、肌钙蛋白t的iod值；c0、a、b、c均为常数；

当k≤10％时，新鲜度为一级甲等，c0＝-8.9*10⁶，a＝54.21,b＝81.11，c＝210.39；

当10％＜k≤20％时，新鲜度为一级乙等，c0＝-7.3*10⁶，a＝62.45,b＝77.51，c＝197.62；

当20％＜k≤40％时，新鲜度为二级甲等，c0＝-5.5*10⁶，a＝43.55,b＝68.41，c＝186.21；

当40％＜k≤60％时，新鲜度为二级乙等，c0＝-3.4*10⁶，a＝62.45,b＝77.51，c＝197.62；

当60％＜k≤80％时，新鲜度为三级甲等，c0＝-1.9*10⁶，a＝59.25,b＝78.97，c＝142.35；

当k＞80％时，新鲜度为三级乙等，c0＝-5.2*10⁵，a＝88.35,b＝93.15，c＝216.22；

本实例中所建立的模型预测均方根差为2.1％。

利用本发明上述鱼肉新鲜度指标k值的预测模型预测待测样品的k值。

取待测冷藏1天草鱼肉样品，测得各骨架蛋白灰度值iod值，分别代入上述各个公式，发现只有当k≤10％时，k为正值，且k＝8.21％，其余公式求得k为负数，不切实际舍去。故本实例中预测得到冷藏1天的草鱼肉样本的k值为8.21％，处于一级甲等鲜度等级；利用国标测得冷藏1天的草鱼k值为6.33％，处于一级鲜度等级；相对误差为0.1％。由此可见，骨架蛋白降解预测模型可以准确预测鲜度等级。

细胞骨架蛋白在贮藏过程中受到生物、理化因素的影响会发生结构改变从而导致质构强度下降、持水力降低等品质劣化现象。在禽畜肉体系中，目前普遍认为，骨架蛋白包括肌间线蛋白(desmin)、肌钙蛋白-t(troponin-t)、伴肌球蛋白(titin)、伴肌动蛋白(nebulin)、整联蛋白(integrin)、肌萎缩蛋白(dystrophin)等等。其中，troponin-t位于肌动蛋白附近，它的降解可能会导致f肌动蛋白完整性及肌动蛋白与肌球蛋白结合强度发生变化，使样品肌节横向移动或者发生断裂，改变肌纤维内部的有序结构从而影响质构品质，肌间线蛋白desmin位于z线以及z线和肌细胞膜之间，它的降解会使z盘弱化，导致剪切力和质构强度下降，titin和nebulin分别位于肌球蛋白、肌动蛋白附近，它们的破坏会导致肌原纤维内部的z线、m线结构的破坏，整联蛋白integrin贯穿于细胞膜，它的降解可以促使细胞膜和细胞骨架之间的水通道快速形成，肌纤维内部水分发生迁移，从而使肌肉持水力降低，水分流失使肉制品质构发生变化。本发明采用伴肌球蛋白，伴肌动蛋白、肌钙蛋白t表征骨架蛋白三者结合作为鱼肉新鲜度的评价指标，取样量少，对检测样本破坏少；无需结合其他化学指标，对生态环境破坏小；检测步骤简洁，节约检测时间，可实现在线实时监测；本发明检测水平达分子级别，准确度高。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。