定量检测华南梅花鹿血液中齐墩果酸的方法与流程

本发明涉及一种野生华南梅花鹿血液中齐墩果酸的定量检测方法。
背景技术：
：齐墩果酸，属于α-香树脂醇型五环三萜类化合物，相对分子量为456，分子式为c30h48o3，化学结构式如式1所示。齐墩果酸在自然界中分布非常广泛，根据中药化学方面的资源调查和分析，目前齐墩果酸至少存在于26个科70多种天然植物中，如灯台树、夏枯草、陆英、车前草、白花蛇舌草、柿蒂、乌梅、女贞子等中草药、乔木中均广泛被检测出。现代中药药理学研究表明，齐墩果酸具有广泛的药理作用和重要的生物活性，尤其表现在抗炎、保肝护肝、抗肿瘤以及调节机体免疫力等方面已经呈现出令人关注的药理特性，其临床应用前景十分诱人。式1、齐墩果酸结构式梅花鹿(cervusnippon)属哺乳纲偶蹄目鹿科动物，是东亚季风区特产的珍贵经济动物，被国际自然和自然资源保护联盟列为濒危动物，属于我国i级保护动物。我国是野生梅花鹿的主要产区，现有四川亚种(c.n.sichuanicus)和华南亚种(c.n.kopscli)，至于东北亚种(c.n.hortulorum)的野生种群尚有待确证。梅花鹿华南亚种目前主要有两大种群：(1)是位于浙江省临安市境内的清凉峰自然保护区与安徽宁国万家乡交界地区的梅花鹿种群；(2)是位于江西省东北部彭泽县桃红岭自然保护区内的梅花鹿种群。其中浙江省临安市境内的清凉峰自然保护区作为我省一个最大的梅花鹿自然保护区，对于我国华南梅花鹿这一野生濒危物种的研究与保护提供了完整的自然生境和一定数量的种群基础。目前，国内人工养殖梅花鹿也很普及，研究表明肠道寄生虫是影响梅花鹿发展的重要疾病，梅花鹿尤其是幼龄梅花鹿感染肠道寄生虫会导致机体健康衰退、生产性能下降，甚至导致死亡。目前国内大部分梅花鹿养殖场均检查出寄生虫感染。近年来，哈佛大学的研究人员理查德—兰厄姆在非洲坦桑尼亚研究黑猩猩时发现，黑猩猩有时候会到一个特殊的地方，在那里找到一种向日葵，将它的嫩叶吞咽下肚，但它们从不将这当作正餐吃。研究表明，这种向日葵的叶子里含有一种红色油状物质，能杀死动物肠道内的寄生虫和真菌，甚至能杀死与艾滋病有关病毒。美国威斯康星大学的卡伦—斯特里厄研究了生活在巴西的一种类人猿。他发现，类人猿甚至可以用挑选的草药来控制生育。如雌猿想怀孕了，它们就会到自己通常活动的范围之外，去采食一种叫猴耳树的果子，这种果子含有一种类似雌激素黄体酮的化学物质，吃过这种果子之后，雌猿就比较容易受孕。而在产下小猿之后，某些雌猿便有目的地大量吃含有植物性雌激素的豆子，以起到避孕的作用。最近两年研究人员发现，梅花鹿在食物丰富的季节也经常啃噬或采食一些药用植物，根据中医药研究发现这些植物含有齐墩果酸、熊果酸等抗炎活性成分，以此来达到治疗或缓解寄生虫所致的梅花鹿肠道炎症。因此，准确定量检测梅花鹿血液中齐墩果酸等天然活性成分的浓度，对于探索梅花鹿在感染寄生虫后的“自我医疗”现象具有重要意义，同时对于探索野生梅花鹿保护措施和方法具有深远影响。现有的检测齐墩果酸的方法——高效液相色谱法，其具有测试相对简便、快速和准确的特点，但目前文献报道的大多采用外标法来进行定量检测，而且也主要是测定中药材或者中药制剂中齐墩果酸含量，鲜见有检测野生动物组织中齐墩果酸含量的报道，且利用上述现有方法测定动物血液中齐墩果酸的含量，存在着以下不足之处：1、文献报道的检测，其基质(原料药或制剂基质)较干净，杂质少，易于分离；而本研究为生物样品——梅花鹿血液中齐墩果酸检测，基质更加复杂。2、相关文献均是采用外标法，与内标法相比，外标法仅仅以待测物的对照品作为标准物质，相对简单，但要求进样量及操作条件保持尽可能稳定和一致性，否则检测方法准确性降低。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种梅花鹿血液中天然抗炎活性成分齐墩果酸的定量检测方法，采用该方法检测齐墩果酸具有准确性高的优点。为了解决上述技术问题，本发明提供一种定量检测华南梅花鹿血液中齐墩果酸的方法，包括以下步骤：1)、在色谱甲醇中加入齐墩果酸标准品(纯度为100％)，漩涡混合均匀后，得齐墩果酸浓度是20μg/ml的对照品母液；利用色谱甲醇将对照品母液稀释成系列浓度的对照品标准液；对系列浓度中的每种对照品标准液均分别依次进行以下步骤2)～5)：2)、系列标准血清的处理：2.1)、在容器(具塞容器)中加入对照品标准液以及加入白术内酯ii标准品(纯度为100％)，漩涡混合均匀，使得容器(每个具塞容器)中白术内酯ii浓度均为20μg/ml，从而对应形成与该对照品标准液相对应的内标液a；2.2)、在容器(具塞容器)中加入内标液a，于40±5℃水浴中氮气流挥干容器中的色谱甲醇，再向容器中加入与内标液a等体积的不含齐墩果酸的梅花鹿血清，漩涡混匀；3)、在步骤2.2)的所得物中加入为步骤2.2)内标液a10±1倍体积量的提取试剂；振荡混匀后以6000±600r/min进行离心5±1分钟，离心所得的上清液为有机相；对有机相进行干燥处理(即，于40～50℃干燥至恒重)；4)、将步骤3)所得的干燥处理后的有机相溶解于流动相中，于18000±2000r/min离心5±1分钟后，获取位于上层的液体层；流动相的体积为步骤2.2)内标液a体积的1/2，所述流动相同步骤5)的流动相；5)、将步骤4)所得的液体层进行高效液相色谱分析，检测条件如下：以体积比为78：22的乙腈与0.05％磷酸溶液作为流动相，流速1.0ml/min、进样量20μl、检测波长为210nm、色谱柱温度为35℃；分别获得标准血清中齐墩果酸与白术内酯ii的吸收峰面积比；由于对系列浓度中的每种对照品标准液分别进行上述步骤2)～5)，从而获得系列浓度中的每种对照品标准液对应的标准血清中齐墩果酸与白术内酯ii的吸收峰面积比；6)、以系列标准血清中齐墩果酸的质量浓度为横坐标，以系列标准血清中的齐墩果酸与白术内酯ii峰面积比值作为纵坐标，绘制标准曲线；7)、在容器中加入白术内酯ii浓度为20μg/ml的色谱甲醇溶液作为内标液b，于40±5℃水浴中氮气流挥干容器中的色谱甲醇，再向容器中加入与内标液b等体积的待测梅花鹿血清；漩涡混匀；所述内标液b与步骤2.2)的内标液a等体积；8)、以步骤7)的所得物替代步骤2.2)的所得物，进行步骤3)～步骤5)，从而获得待测梅花鹿血清中齐墩果酸与白术内酯ii峰面积比值；将待测梅花鹿血清中齐墩果酸与白术内酯ii峰面积比值代入所述标准曲线中，得到梅花鹿血清中齐墩果酸的质量浓度。作为本发明的定量检测华南梅花鹿血液中齐墩果酸的方法的改进：所述步骤3)中的提取试剂为乙酸乙酯。作为本发明的定量检测华南梅花鹿血液中齐墩果酸的方法的进一步改进：所述步骤1)中，对照品母液分别稀释成20.0、10.0、5.0、1.0、0.5和0.1μg/ml此系列浓度的系列标准液。作为本发明的定量检测华南梅花鹿血液中齐墩果酸的方法的进一步改进：所述步骤2.2)的内标液a与步骤7)的内标液b的体积用量均为0.2ml；所述步骤3)中乙酸乙酯的体积用量为2.0ml。作为本发明的定量检测华南梅花鹿血液中齐墩果酸的方法的进一步改进：所述步骤6)中，利用标准曲线所得的曲线方程为y＝0.0512x+0.0043(r2＝0.9999)。在本发明中，选择白术内酯ii作为齐墩果酸定量的内标物，在步骤2)中的内标物白术内酯ii浓度设定为20μg/ml。为了验证本发明的方法的准确性和实用性，发明人进行了如下的试验：1、标准曲线制备准确称取齐墩果酸和白术内酯ii标准品分别溶解于色谱甲醇中，作为储备液，利用色谱甲醇将齐墩果酸储备液分别稀释成20.0，10.0，5.0，1.0，0.5，0.1μg/ml系列标准液，以上述系列标准液将白术内酯ii稀释成20μg/ml内标液。取6支具塞离心管，向上述每个离心管中准确加入白术内酯ii内标液0.2ml。然后将上述每个离心管于40℃水浴中氮气流挥干所有甲醇，向每个离心管中准确加入不含齐墩果酸的梅花鹿血清0.2ml，漩涡混匀1min，使得每个离心管中内标物白术内酯ii浓度均为20μg/ml，而齐墩果酸浓度分别为20.0、10.0、5.0、1.0、0.5和0.1μg/ml的系列浓度。按照上述步骤3)～步骤5)进样分析，以齐墩果酸与白术内酯ii峰面积比值(y)为纵坐标，以齐墩果酸质量浓度(x)为横坐标作标准曲线，求出标准曲线方程和相关系数(r)，即：y＝0.0512x+0.0043(r2＝0.9999)。2、回收率和精密度制备含齐墩果酸的标准曲线范围内高、中、低浓度空白样品0.1，1.0，10.0μg/ml作为质控样品(qc)，按照上述条件进样分析，每个浓度样品重复5次，以样品中齐墩果酸与内标物峰面积比值和相同浓度下标准样品中齐墩果酸与内标物峰面积比值之比，计算高、中、低3种浓度下回收率。制备含齐墩果酸标准曲线范围内高、中、低浓度空白样品0.1，1.0，10.0μg/ml作为质控样品(qc)，按照上述条件进样分析，比较以上样品于日内5次进样和日间5次进样的齐墩果酸与内标物峰面积比值的变化幅度，计算日内和日间5次进样所得齐墩果酸峰面积的变异系数(rsd)，从而得出日内和日间精密度。备注说明：所述高、中、低浓度空白样品0.1，1.0，10.0μg/ml，制备方法为：不含有齐墩果酸的梅花鹿血清作为空白样品，然后准确加入齐墩果酸使其浓度分别为0.1，1.0，10.0μg/ml。3表1、齐墩果酸的回收率和精密度本发明具有如下技术优势：1)、本发明采用内标法进行定量，选择白术内酯ii作为内标物。现有技术大多采用外标法定量，但难以保证检测方法的准确性；而本发明采用内标法定量，内标物选择较适中。此外，由于齐墩果酸的最大吸收波长是210nm，齐墩果酸本身在此波长下生物样品中杂质较多，从而使得齐墩果酸色谱峰定量不准，采用内标法可使得其准确度得到显著提高。即，外标法仅仅以待测物的对照品作为标准物质，虽然相对简单，但要求进样量及操作条件保持尽可能稳定和一致性，否则检测方法准确性降低，而定标法具有定量准确、精密度高等优点。2)、本发明经过大量的试验筛选，内标物白术内酯ii浓度定为20μg/ml，能够准确定量齐墩果酸在梅花鹿血清中浓度；3)、本发明在流动相中加入了一定比例的乙腈(78％，v/v)，同时采用磷酸溶液替换磷酸盐缓冲液，大大减少色谱柱损伤；此外，降低了磷酸的浓度(0.05％，v/v)，从而对色谱柱损伤更小，全血中生物杂质洗脱更快、更全面，从而对齐墩果酸和白术内酯ii色谱峰无干扰。本发明不仅能检测血清中齐墩果酸含量，而且还可以用于研究齐墩果酸在不同动物组织中的浓度或细胞内的跨细胞膜转运规律。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1是本发明的梅花鹿血清中齐墩果酸和内标白术内酯ii的色谱图；色谱峰1为内标物白术内酯ii；色谱峰2为齐墩果酸；图2是实施例的血清中齐墩果酸标准曲线图；图3是对比例1-1的血清中齐墩果酸标准曲线图；图4是对比例1-2的血清中齐墩果酸标准曲线图；图5是对比例2-1的血清中齐墩果酸标准曲线图；图6是对比例2-2的血清中齐墩果酸标准曲线图；图7是对比例3-1的血清中齐墩果酸标准曲线图；图8是对比例3-2的血清中齐墩果酸标准曲线图；图9是对比例4-1的血清中齐墩果酸标准曲线图；图10是对比例4-2的血清中齐墩果酸标准曲线图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1、一种梅花鹿血液中齐墩果酸的定量检测方法，依次进行以下步骤：1)、在色谱甲醇中加入纯度为100％的齐墩果酸标准品，漩涡混合均匀后，得齐墩果酸浓度是20μg/ml的对照品母液；利用色谱甲醇将对照品母液稀释成系列浓度的对照品标准液，即，依次稀释成20.0、10.0、5.0、1.0、0.5和0.1μg/ml的系列标准液。对系列浓度的6种对照品标准液中的每种均分别进行以下步骤2)～5)：2)、系列标准血清的处理：2.1)、在干燥带塞离心管中加入对照品标准液以及加入纯度为100％的白术内酯ii标准品，漩涡混合均匀，使得每个离心管中白术内酯ii浓度均为20μg/ml，从而对应形成与该对照品标准液相对应的内标液a；即，上述对应形成的6种内标液a中，白术内酯ii浓度均为20μg/ml。2.2)、在干燥带塞离心管中加入0.2ml的内标液a，然后于40℃水浴中氮气流挥干色谱甲醇，向离心管中准确加入不含齐墩果酸的梅花鹿血清0.2ml，漩涡混匀1min，使得每个离心管中内标物白术内酯ii浓度均为20μg/ml，而齐墩果酸浓度分别为20.0、10.0、5.0、1.0、0.5和0.1μg/ml的系列浓度。3)、在步骤2.2)的所得物中加入2.0ml的提取试剂乙酸乙酯，振荡混匀后以6000r/min进行离心(约5分钟)，离心所得的上清液为有机相；并对所获取的有机相进行干燥处理(于45℃干燥至恒重)；4)、将上述干燥处理后的有机相溶解于体积比＝78：22的乙腈与0.05％磷酸溶液组成的0.1ml流动相中，18000r/min离心(约5分钟)后，获取位于上层的液体层；5)、将步骤4)所得的液体层进行高效液相色谱分析，检测条件如下：以体积比＝78：22的乙腈与0.05％(体积％)磷酸溶液(磷酸水溶液)作为流动相，流速1.0ml/min、进样量20μl、检测波长为210nm、色谱柱温度为35摄氏度；分别获得系列标准血清中齐墩果酸与白术内酯ii的吸收峰面积比；6)、以系列标准血清中齐墩果酸的质量浓度为横坐标，以其中齐墩果酸与白术内酯ii峰面积比值作为纵坐标，绘制标准曲线，并计算曲线方程和相关系数，y＝0.0512x+0.0043(r2＝0.9999)；7)、在容器中加入白术内酯ii浓度为20μg/ml的色谱甲醇溶液作为的内标液b0.2ml，于40±5℃水浴中氮气流挥干容器中的色谱甲醇，再向容器中加入待测梅花鹿血清0.2ml；漩涡混匀；使得待测梅花鹿血清中内标物白术内酯ii浓度也为20μg/ml。8)、以步骤7)的所得物替代步骤2.2)的所得物，进行步骤3)～步骤5)，从而获得待测梅花鹿血清中齐墩果酸与白术内酯ii峰面积比值；然后将待测梅花鹿血清中齐墩果酸与白术内酯ii峰面积比值代入所得曲线方程中，计算得到梅花鹿血清中齐墩果酸的质量浓度。梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定的实验：从小围栏中随机麻醉1只采食含有齐墩果酸中药的梅花鹿，每只采集血液10ml于抗凝离心管中，于3000r/min低温离心5min，取出全部上层血清，于-20℃冰箱中保存备用。按照上述实施例1所述方法进行检测，所得结果为：表2、梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定对比例1-1、将实施例1中作为内标物的白术内酯ii取消，采用外标法，即，为：取消步骤2.1)，在步骤2.2)中直接使用对照品标准液替代内标液a，从而分别获得系列标准血清中齐墩果酸的吸收峰面积；在0.1-20μg/ml浓度范围内标准曲线为：y＝11705x–454.85(r2＝0.9981)。以齐墩果酸峰面积为纵坐标，以齐墩果酸质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算曲线方程和相关系数。在步骤7)中，取消内标液b的使用，直接向容器中加入待测梅花鹿血清，从而获得待测梅花鹿血清中齐墩果酸的吸收峰面积；然后将待测梅花鹿血清中齐墩果酸峰面积代入上述曲线方程中，计算得到梅花鹿血清中齐墩果酸的质量浓度。按照此对比例1-1进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表1-1-1所示。此时以样品中齐墩果酸峰面积和相同浓度下标准样品中齐墩果酸之比，计算高、中、低3种浓度下回收率。比较以上样品于日内5次进样和日间5次进样的齐墩果酸峰面积变化幅度，计算日内和日间5次进样所得齐墩果酸峰面积的变异系数(rsd)，从而得出日内和日间精密度。表1-1-1、齐墩果酸的回收率和精密度按照此对比例1-1进行“梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定”的实验，所得的梅花鹿血清中齐墩果酸浓度如表1-1-2所示。表1-1-2、梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定对比例1-2、将实施例1步骤1)中的内标物白术内酯ii换成白术内酯iii，其余等同于实施例1。在0.1-20μg/ml浓度范围内标准曲线为：y＝0.0484x+0.0302(r2＝0.9867)。按照此对比例1-2进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表1-2-1所示：表1-2-1、齐墩果酸的回收率和精密度按照此对比例1-2进行“梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定”的实验，所得的梅花鹿血清中齐墩果酸浓度如表1-2-2所示。表1-2-2、梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定对比例2-1、将实施例1内标液a、内标液b中白术内酯ii浓度由20μg/ml改成5μg/ml，其余等同于实施例1。在0.1-20μg/ml浓度范围内标准曲线为：y＝0.168x+0.086(r2＝0.9963)。按照此对比例2-1进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表2-1-1所示：表2-1-1、齐墩果酸的回收率和精密度按照此对比例2-1进行“梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定”的实验，所得的梅花鹿血清中齐墩果酸浓度如表2-1-2所示。表2-1-2、梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定对比例2-2、将实施例1内标液a、内标液b中白术内酯ii浓度由20μg/ml改成40μg/ml，其余等同于实施例1。在0.1-20μg/ml浓度范围内标准曲线为：y＝0.0237x+0.0085(r2＝0.9964)。按照此对比例2-2进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表2-2-1所示：表2-2-1、齐墩果酸的回收率和精密度按照此对比例2-2进行“梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定”的实验，所得的梅花鹿血清中齐墩果酸浓度如表2-2-2所示。表2-2-2、梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定对比例3-1、将实施例1步骤3)中乙酸乙酯的用量由“2ml”改成“1ml”；其余等同于实施例1。在0.1-20μg/ml浓度范围内标准曲线为：y＝0.0469x+0.02(r2＝0.9945)。按照此对比例3-1进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表3-1-1所示：表3-1-1、齐墩果酸的回收率和精密度按照此对比例3-1进行“梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定”的实验，所得的梅花鹿血清中齐墩果酸浓度如表3-1-2所示。表3-1-2、梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定对比例3-2、将实施例1步骤3)中乙酸乙酯的用量由“2ml”改成“6ml”；其余等同于实施例1。在0.1-20μg/ml浓度范围内标准曲线为：y＝0.0468x+0.0107(r2＝0.9979)按照此对比例3-2进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表3-2-1所示：表3-2-1、齐墩果酸的回收率和精密度按照此对比例3-2进行“梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定”的实验，所得的梅花鹿血清中齐墩果酸浓度如表3-2-2所示。表3-2-2、梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定对比例4-1、将实施例1中的流动相由“体积比＝78:22的乙腈与0.05％磷酸溶液”改成“体积比＝85:15的乙腈与0.05％磷酸溶液”；其余等同于实施例1。在0.1-20μg/ml浓度范围内标准曲线为：y＝0.0475x+0.0207(r2＝0.9969)。按照此对比例4-1进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表4-1-1所示：表4-1-1、齐墩果酸的回收率和精密度按照此对比例4-1进行“梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定”的实验，所得的梅花鹿血清中齐墩果酸浓度如表4-1-2所示。表4-1-2、梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定对比例4-2、将实施例1中的流动相由“体积比＝78:22的乙腈与0.05％磷酸溶液”改成“体积比＝65:35的乙腈与0.05％磷酸溶液”；其余等同于实施例1。在0.1-20μg/ml浓度范围内标准曲线为：y＝0.0472x+0.0163(r2＝0.9985)按照此对比例4-2进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表4-2-1所示：表4-2-1、齐墩果酸的回收率和精密度按照此对比例4-2进行“梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定”的实验，所得的梅花鹿血清中齐墩果酸浓度如表4-2-2所示。表4-2-2、梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定对比例5、将实施例1的流动相中的“0.05％磷酸溶液”改成常规的磷酸盐缓冲液(ph7.4)，其余等同于实施例1。在0.1-20μg/ml浓度范围内标准曲线为：y＝0.0473x+0.0132(r2＝0.9994)。按照此对比例5进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表5-1所示：表5-1、齐墩果酸的回收率和精密度按照此对比例5进行“梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定”的实验，所得的梅花鹿血清中齐墩果酸浓度如表5-2所示。表5-2、梅花鹿血清中齐墩果酸含量测定根据上述表的对比，可得知：根据本发明所述处理方法，研究了不同内标物、不同内标物白术内酯ii浓度、不同乙酸乙酯提取体积以及不同流动相比例，梅花鹿血清中齐墩果酸标准曲线(含相关系数)、回收率、变异系数以及梅花鹿样品中齐墩果酸浓度变化较大。采用本发明处理方法，所得齐墩果酸标准曲线相关系数最高，血清中齐墩果酸回收率最高，日内变异系数和日间变异系数最小(见表1)，通过对小围栏中梅花鹿血清中齐墩果酸血清浓度检测，采用本发明血清中齐墩果酸浓度变异最小(见表2)。即：本发明所采用的处理方法，能够最大程度的去除梅花鹿血清中各种内源性和外源性杂质对齐墩果酸分析检测的干扰，从而使得齐墩果酸定量分离、检测达到最优化。实验1、将以下3份待测品：梅花鹿血清a、血清b、血清c按照实施例1所述方法进行检测，得待测梅花鹿血清中的齐墩果酸浓度；所得结果如下表3；表3验证实验、按照lc-ms方法对全血进行检测，所得的全血中尼古丁浓度如下表4：表4梅花鹿血清中齐墩果酸的浓度全血a0.35全血b0.62全血c1.50最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页12