一种鹿角胶中鹿、牛源性多重荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用与流程

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种鹿角胶中鹿、牛源性多重荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。属于胶类中药动物源性检测技术领域。

背景技术：

鹿角胶为鹿科动物梅花鹿（Cevusnippon Temminck）或马鹿（Cevusnippon elaphusl）的角经水煎煮、浓缩制成的固体胶，始载于《神农本草经》，称白胶，与阿胶并列为上品。在《本草逢原》中称为鹿胶，味甘、咸，性温，入肝、肾两经，具有温补肝肾，益精养血等功效。长期服用可以滋养强壮，补血止血，抗衰防老，适用人群广泛。

据2015年版《中国药典》记载，鹿角胶为鹿角经水煎熬、浓缩制成的固体胶，为单一来源的固体胶，不允许添加其他胶类。然而，由于鹿角胶的生产原料有限，价格昂贵，加上现行药典不能准确有效的检测出鹿角胶是否添加了其他胶原成分，因此假冒伪劣现象时有发生。有的生产企业为了降低成本，在鹿角胶生产加工过程中掺入其他动物的皮毛，包括廉价的猪皮、牛皮等。致使鹿角胶行业产品价格悬殊，质量参差不齐，真假难辨。若消费者长时间服用劣质鹿角胶，可能会对身体造成伤害，达不到相应的疗效。劣质鹿角胶产品的出现影响整个鹿角胶产业链的健康发展。这就要求发展更加可信、灵敏的检测技术来满足监管部门的治疗控制与监管的要求。

随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，DNA分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它可以突破依据感官检测的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。以聚合酶链式反应（PCR）为基础的技术已逐步成为了食品药品中动物源性成分种属鉴定的核心方法。近年来实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，并使得成分含量的定量溯源成为可能，由于荧光定量整个检测过程为闭管操作，所以有效的减少了实验过程中的污染的危险，广泛应用于各个领域。

目前，对于鹿角胶的鉴定主要还是从多肽角度利用质谱定性检测，专利CN103630620A利用多肽差异性，通过加入限制性内切酶来检测鹿角胶中溯源鉴定。但这些方法均针对鹿角胶中多肽差异性进行鉴定，而由于技术的局限性，灵敏度和假阳性比率相对较高，判定上不够准确。因此，传统的鉴别方法不能完全满足当前鹿角胶真伪鉴别的要求。而利用实时荧光定量PCR检测鹿角胶中鹿、牛源性的研究目前在国内还尚未报道。

技术实现要素：

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种鹿角胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种同时检测鹿角胶中鹿、牛源性荧光PCR检测引物，其核苷酸序列如下：

正向引物UF序列：5’-CTGATGGTGCAACCGCTATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；

反向引物UR序列：5’-TCTAGGGCAGGGTTTTGTGTT-3’，如SEQ ID NO.2所示。

一种同时检测鹿角胶中鹿、牛源性荧光PCR检测探针，包括：

鹿特异性探针LUP序列：5’-TAAGGAAACAACAACACTCTTTATGGG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

牛特异性探针NP序列：5’-CCGGAGTAATCCAGGTCGGT- 3’，如SEQ ID NO.4所示。

作为优选的技术方案之一，鹿特异性探针序列和牛特异性探针序列的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。

作为优选的技术方案之一，

鹿特异性探针LUP序列为：5’-FAMTAAGGAAACAACAACACTCTTTATGGG-BHQ1 3’，如SEQ ID NO.3所示；

牛特异性探针NP序列为：5’-JOECCGGAGTAATCCAGGTCGGT-BHQ2 3’，如SEQ ID NO.4所示。

一种同时检测鹿角胶中鹿、牛源性荧光PCR检测试剂盒，包括上述荧光PCR检测引物、探针，以及龟甲胶DNA提取液和多重实时荧光PCR反应扩增体系。

作为优选的技术方案之一，所述PCR检测试剂盒还包括内标质控体系，所述内标质控体系包括质控体系引物、质控体系探针和质控体系序列，各核苷酸序列如下：

（1）质控体系引物：

上游引物UF序列：5’-CTGATGGTGCAACCGCTATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物UR序列：5’-TCTAGGGCAGGGTTTTGTGTT-3’，如SEQ ID NO.2所示。

（2）质控体系探针CntP：5'TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT- 3'，如SEQ ID NO.5所示；

（3）质控体系Isqc序列：

CTGATGGTGCAACCGCTATCTAATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCGGAAAG AACACAAAACCCTGCCCTAGA，如SEQ ID NO.6所示。

作为进一步优选的技术方案之一，质控体系探针CntP的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。

作为优选的技术方案之一，所述PCR检测试剂盒还包括鹿和牛阳性标准品、阴性对照品和空白对照品。作为优选的技术方案之一，所述多重实时荧光PCR反应扩增体系包括：2×qPCR Master Mix 10μL，引物对10μM取1μL，探针用量LUP（鹿）和NP（牛）终浓度0.25μM，DNA用量1-50ng/μL取2μL，用双蒸水补足20μL。

上述引物、探针或试剂盒在同时鉴别鹿角胶中鹿和牛源性成分中的应用。

一种同时鉴别鹿角胶中鹿和牛源性成分的多重实时荧光定量PCR检测（Multiplex Quantitative Real-time PCR）方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品DNA，选择靶基因，并进行引物设计和含有阳性扩增内标DNA的重组质粒的构建；

（2）使用上述试剂盒进行PCR扩增；

（3）设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定鹿角胶中是否含有鹿和牛源性成分。

作为优选的技术方案之一，步骤（1）中DNA的提取按照专利CN201410317118.7中阿胶DNA提取技术进行提取。

作为优选的技术方案之一，步骤（1）中靶基因选自线粒体16SrDNA基因，因为相比基因组而言，线粒体在组织中拷贝数高，而且龟甲胶经过深度加工后破坏程度相对小。

作为优选的技术方案之一，步骤（1）中，阳性内标DNA的重组质粒的构建方法如下：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后没有出现与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上游5’端连接上鹿和牛源性通用上游引物，下游3’端鹿和牛源性通用下游引物序列，从而形成110bp的阳性扩增内标DNA序列，将这段扩增内标序列委托人工基因合成，合成片段连接载体PMD18-T，转化感受态DH5a，质粒提取，并测序验证，得到能与鹿和牛源性共用一对特异性引物，从而构建阳性内标DNA的重组质粒。各核苷酸序列见表1。

表1. 引物探针序列

作为优选的技术方案之一，步骤（2）是将引物及探针放入同一反应体系中共同扩增，无需开管，避免污染。PCR反应体系见表2。

表2. PCR反应体系

作为优选的技术方案之一，步骤（2）中的PCR扩增条件为：95℃，10min；95℃，10s；63℃，35s，在此收集荧光信号，45个循环。

作为优选的技术方案之一，所述PCR扩增为扩增阶段反应在至少3通道型号的荧光定量PCR仪上进行，根据不同型号的PCR仪的不同要求可以对标记荧光号进行相应的调整。

本发明的有益效果：

本发明的试剂盒检测灵敏度高、特异性好，可以实现快速、同时鉴别鹿角胶中鹿、牛源性成分。

本发明能够快速的检测到鹿角胶及其制品中鹿、牛源性，从而辨别真伪，具有重复性好、特异性强、准确度高、通量大、使用方便、耗时短的特点。同时，本发明的方法有效的克服了鹿角胶成品经过高温炮制导致DNA降解而导致提取困难不完整的难题，可为鹿角胶生产加工质量监控及监管部门在监管中具有很高的应用价值。

附图说明

图1为FAM荧光修饰鹿源性特异探针有扩增曲线，说明待测样本检出鹿源性成分。

图2为JOE荧光修饰牛源性特异探针有扩增曲线，说明待测样本检出牛源性成分。

图3为FAM和JOE荧光修饰探针同时有扩增曲线，说明待测样本检出鹿和牛源性成分。

图4为试剂盒鹿源性检测灵敏度扩增曲线图，检测限为0.01ng。

图5为试剂盒牛源性检测灵敏度扩增曲线图，检测限为0.01ng。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明中所用实验材料、试剂与仪器如下：

实验材料：

鹿、龟、鱼、牛、驴、马、狐狸、水貂、貉子、狗、兔、鸡、鸭、鹅、骆驼、玉米等动物皮张或新鲜组织，鹿角胶不同批次的样品共20份，均购自济南市。

所用试剂：

动物组织提取试剂盒为OMEGA品牌。DNA分子量MakerDL1000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。引物与探针由生工生物工程（上海）有限公司负责合成。2×TaqMan Master Mix为DBI Bioscience品牌。DNA测序由山东省农业科学院生物技术中心测序中心完成。

所用仪器：ABI 7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，Takara PCR仪为宝生物工程（大连）有限公司产品。5424 D型高速离心机为Eppendorf公司产品。

实施例1

鹿角胶样品DNA提取，采用专利201410317118.7（一种从阿胶中快速提取DNA的试剂盒及其提取方法）中公开的方法进行提取，步骤不再赘述，提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8～1.9左右，浓度在10ng/μl以上，说明DNA纯度较高，浓度适中，符合PCR扩增要求。

1、靶基因的选择和引物的设计：相比基因组而言，线粒体在组织中拷贝数高，而且鹿角胶经过深度加工后破坏程度相对小，所以优先选用线粒体16S DNA基因。设计鹿和牛通用外侧引物及内侧引物，扩增片段小，使引物与靶点更容易结合。引物探针序列见表1。

2、鹿角胶中鹿源性成分的定量检测：选用20 μL的实时荧光多重PCR扩增体系,含TaqMan reaction Mix （2x）10μl，Lu-P2.0 μM, Bovine -P 2.0 μM，鹿特异性正反向引物UNVIF1/R1 5.0 μM，牛特异性正反向引物UNVIF1/R1 5.0 μM，待测样本总DNA 2.0 μL，用双蒸水补足20 μL反应体系。阴性模板对照加无菌双蒸水。20μL反应体系见表2.

3、本发明优先选用PCR扩增条件：PCR扩增条件为：95℃3min； 95℃ 10s，62℃，35s，在此收集荧光信号，45个循环。

4、结果分析：每次试验设立阳性对照、阴性对照及空白对照，试验结束后打开分析软件，分析实验结果，给出ΔRn（第n个循环时的荧光增加值）与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定鹿角胶中是否含有鹿和牛源性成分。结果见图1，FAM荧光修饰鹿源性特异探针有扩增曲线时，说明待检样本检出鹿源性成分，图2，JOE荧光修饰牛源性特异探针有扩增曲线时，说明待检样本检出牛源性成分，图3，FAM荧光修饰鹿源性特异探针和JOE荧光修饰牛特异探针同时有扩增曲线时，说明为样本同时检出鹿和牛源性成分。

实施例2特异性验证

利用本发明设计的引物和探针，分别以鹿、龟、鱼、牛、驴、马、狐狸、水貂、貉子、狗、兔、鸡、鸭、鹅、骆驼、玉米等动物皮张或新鲜组织的总基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR检测，验证其引物和探针的特异性。其结果见表3，结果表明本研究所设计的探针及引物具有很强的特异性。

表3. 特异性验证试验

实施例3灵敏度实验

将鹿、牛基因组DNA分别定量到50 ng，按10×梯度稀释（10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5），每个梯度均取2.0 μL为模板量，（即：10 ng，1 ng，0.1 ng，0.01 ng，0.001 ng）进行实时荧光定量PCR检测，评估本发明的检测限。见图4和图5，结果表明本方法定量检测限为0.1ng，说明本发明所提供的方法具有很高的灵敏度。

实施例4实际样品检测应用

市售样本20份，不同品牌厂家及不同生产批次，按照本发明提供的检测方法，提取DNA后进行实时荧光PCR检测，见表4，其中10份样品检测出鹿源性，3份检测出牛源性，5份样本同时检测出鹿和牛源性成分，2份样本未检出鹿和牛源性。说明本发明提供的检测方法具有很好的应用价值。

表4. 实际样本检测

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学研究院生物技术研究中心

<120> 一种鹿角胶中鹿、牛源性多重荧光PCR检测引物、探针组合物、试剂盒及检

测方法与应用

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 正向引物UF

<400> 1

ctgatggtgc aaccgctatc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 反向引物UR

<400> 2

tctagggcag ggttttgtgt t 21

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 鹿特异性探针LUP

<400> 3

taaggaaaca acaacactct ttatggg 27

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 牛特异性探针NP

<400> 4

ccggagtaat ccaggtcggt 20

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT

<400> 5

tgacgctagt aggcaagtac gctccatt 28

<210> 6

<211> 110

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 质控体系IsqcP序列

<400> 6

ctgatggtgc aaccgctatc taatggagca cgccgtaagc ttaacctgac gctagtaggc 60

aagtacgctc cattggtgac ctcggaaaga acacaaaacc ctgccctaga 110