WFDC21P在肝癌诊治中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及WFDC21P在肝癌诊治中的应用。

背景技术：

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，是世界范围内肿瘤导致死亡的主要因素之一。80％的新发肝癌病例出现在发展中国家，肝细胞癌(HCC)是中国癌症死亡的主要原因之一。尽管局部治疗如手术和经导管动脉化学栓塞能够治疗肝癌，但肝癌病人仍有很高的复发和转移率。而HCC的复发或转移的分子机制目前仍然不是很清楚。上皮-间质转化(EMT)和间质-上皮转化(MET)在癌症转移进程中发挥着重要的作用。特别是，已发现EMT可能是肿瘤转移播散和治疗时获得抗药性的重要原因。最近的数据也表明，表观遗传的改变，也参与了癌症的转移过程。

最近人们发现，在人类基因组中除了有microRNA这一具有强大调控和表观遗传修饰功能的微小非编码RNA的存在，还存在着数以万计的另一种非编码RNA即长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)长链非编码是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们不具有编码蛋白的功能。lncRNA起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，是基因组转录的“噪音、垃圾”，不具有生物学功能。然而，最近的研究表明，它们可以通过DNA甲基化、组蛋白修饰、转录后调控、RNA干扰、印迹基因等多种不同的机制、在多种层面上影响基因的表达水平。因此，lncRNA可能成为肝癌研究的新方向。现有技术中已经报道microRNA在肝癌发生发展以及耐药中具有重要作用，但是同样作为非编码产物的lncRNA，其生物学功能以及其在肝癌发生发展过程中的作用却不清楚，需要进一步的研究。

目前，在肿瘤组织中发现的异常表达的lncRNA可涉及全身各个系统，分布较为广泛，但是由于lncRNA数量庞大，目前针对lncRNA在癌症领域中的研究仍处在起步阶段，因此探寻LncRNA肝癌的分子基础具有重要意义。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种诊断产品，为实现肝癌的早期诊断提供基础。

本发明的目的之二，提供一种用于肝癌临床诊断和治疗中以及机制研究的分子标志物。

本发明的目的之三，提供一种治疗手段和药物组合物，通过降低靶向分子的转录水平，实现肝癌的精准分子治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测WFDC21P转录水平的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用，其中，WFDC21P在肝癌患者中转录水平上调。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别WFDC21P的探针；或

特异性扩增WFDC21P的引物。

本发明提供了一种诊断肝癌的产品，所述产品能够通过检测样本中WFDC21P的转录水平来诊断肝癌。所述“样本”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。

进一步，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒；其中，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测WFDC21P转录水平的针对WFDC21P的寡核苷酸探针；所述基因检测试剂盒包括用于检测WFDC21P转录水平的试剂。

本发明提供了WFDC21P基因在筛选预防或治疗肝癌潜在物质中的应用。

本发明提供了一种筛选预防或治疗肝癌的潜在物质的方法，所述方法包括：

用候选物质处理表达或含有WFDC21P基因或的体系；和

检测所述体系中WFDC21P基因的转录；

其中，若所述候选物质可降低WFDC21P基因的转录水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该候选物质是预防或治疗肝癌的潜在物质。所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

所述候选物质包括(但不限于)：针对WFDC21P基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明提供了WFDC21P在制备治疗肝癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括WFDC21P功能性表达的抑制剂，所述抑制剂选自：以WFDC21P或其转录本为靶序列、且能够抑制WFDC21P基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。优选的，所述的抑制剂为siRNA。

进一步，所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明提供了一种治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括：

WFDC21P功能性表达的抑制剂；和

药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体包括(但不限于)缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂、消泡剂。

附图说明

图1是利用QPCR检测WFDC21P在肝癌患者中的表达情况图；

图2是利用QPCR检测WFDC21P在肝癌细胞中的表达情况图；

图3是利用QPCR检测转染WFDC21P在肝癌细胞中的转染情况图；

图4是利用CCK8检测WFDC21P对肝癌细胞增殖的影响图；

图5是利用软琼脂克隆形成实验检测WFDC21P表达对肝癌细胞增殖能力的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量方法，采用目前覆盖数据库最广的lncRNA芯片，检测肝癌标本中lncRNA在肝癌患者和健康人中转录水平，发现其中具有明显表达差异的lncRNA片段，探讨其与肝癌的发生之间的关系，从而为肝癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了肝癌中WFDC21P显著性上调。实验证明，siRNA干扰沉默WFDC21P，能够有效地抑制肝癌细胞的增殖，为肝癌的个性化治疗提供了新途径。

WFDC21P基因

WFDC21P基因位于17号染色体长臂2区3号带上，该基因目前存在8个转录本，一种代表性的人WFDC21P基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中的WFDC21P包括野生型、突变型或其片段。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95-98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

或者，当核酸或其片段与另一核酸(或其互补链)、一条链或其互补序列在选择性杂交条件下杂交时，则其间存在基本同源或(相同性)。当杂交比特异性整体丧失发生更具选择性时，存在杂交选择性。典型地，当在至少大约14个核苷酸的一段序列存在至少大约55％相同性、优选至少大约65％、更优选至少大约75％及最优选至少大约90％相同性时，发生选择性杂交。如本文所述，同源对比的长度可以是较长的序列节段，在某些实施方案中通常为至少大约20个核苷酸，更通常为至少大约24个核苷酸，典型为至少大约28个核苷酸，更典型为至少大约32个核苷酸，及优选至少大约36或更多个核苷酸。

因此，本发明的多核苷酸与SEQ ID NO.1优选具有至少75％、更优选至少85％、更优选至少90％同源性。更优选地，存在至少95％、更优选至少98％同源性。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

检测技术

本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

芯片、试剂盒

在本发明中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于WFDC21P所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleic acid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测WFDC21P的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片可用于检测包括WFDC21P基因在内的多个基因(例如，与肝癌相关的多个基因)的转录水平，将肝癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高肝癌诊断的准确率。

抑制剂和药物组合物

基于发明人的发现，本发明提供了一种WFDC21P的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制WFDC21P基因的功能性表达即可，这些抑制剂作为对于下调WFDC21P有用的物质，可用于预防或治疗肝癌。

作为本发明的一种优选方式，所述WFDC21P的抑制剂是一种WFDC21P特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染肝癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中WFDC21P基因的转录水平，以及肝癌细胞的增殖。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的WFDC21P的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制肝癌。任何前述的WFDC21P的抑制剂均可用于药物组合物的制备。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞(宿主细胞)转染试剂。

本发明可以采用用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将WFDC21P的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带WFDC21P的抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA或shRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的WFDC21P抑制剂，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种抗癌剂。在具体的实施方案中，药物组合物包含至少一种抑制WFDC21P基因表达的化合物和至少一种化疗剂。用于本发明的化疗剂，包括但不限于：微管激活剂、烷化剂、抗赘生抗代谢物、铂类化合物、DNA-烷化剂，抗肿瘤抗生素剂，抗代谢剂，微管蛋白稳定剂，微管蛋白去稳定剂，激素拮抗剂，拓扑异构酶抑制剂，蛋白激酶抑制剂，HMG-COA抑制剂，CDK抑制剂，细胞周期蛋白抑制剂，胱天蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，反义核酸，三链螺旋DNA，核酸适体，和分子修饰的病毒、细菌和外毒素试剂。

可药用载体可包括但不限于：病毒、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。相关的递送载剂可包括但不限于：脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。

本发明的药物组合物还可与其他治疗肝癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肝癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集10例肝癌患者的癌组织以及癌旁组织，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，按说明书的具体步骤进行操作。

3、逆转录和标记

用Low RNA Input Linear Amplification Kit将mRNA逆转录成cDNA，同时用Cy3分别标记实验组和对照组。

4、杂交

基因芯片采用康城生物-Human lncRNA Array，按芯片使用说明书的步骤进行杂交。

5、数据处理

杂交后芯片用Agilent扫描仪扫描,分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％PMT各扫描1次，2次结果Agilent软件自动合并。扫描图像数据采用Feature Extraction进行处理分析，得到的原始数据应用Bioconductor程序包进行后续数据处理。最后Ratio值为实验组和对照组。差异基因筛选标准：ratio≥4为上调基因，ratio≤0.25为下调基因。

6、结果

与癌旁组织相比，WFDC21P在肝癌组织中的转录水平显著高于癌旁组织。

实施例2QPCR测序验证WFDC21P基因的差异表达

1、对WFDC21P基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式收集肝癌组织和癌旁组织样本各60例。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mM dNTP，0.1mM DTT，30μM Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

(3)QPCR扩增检验

引物设计：

WFDC21P基因的引物序列为：

正向引物：5’-TCTATTGACTGAAGTTGAC-3’(SEQ ID NO.2)

反向引物：5’-ATTATGTCTCTGGGTCTT-3’(SEQ ID NO.3)

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’(SEQ ID NO.4)

反向引物：5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3’(SEQ ID NO.5)

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正反向引物(5μM)各1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。

扩增程序为：95℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35个循环。

以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如图1所示，与癌旁组织相比，WFDC21P基因在肝癌组织中转录水平上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3WFDC21P基因在肝癌细胞系中的差异表达

1、细胞培养

人肝癌细胞株HepG2、Huh7和正常肝细胞系HL-7702，，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、RNA的提取

1)胰酶消化贴壁细胞，吹打获得的细胞经离心、重悬、清洗后，以含10％FBS的DMEM培养基重悬；

2)将重悬的细胞转移至6孔板，添加培养基至2m1/孔，轻摇6孔板使细胞均匀重悬；

3)细胞贴壁生长48h，去培养基；

4)以1mlTrizol试剂裂解细胞，反复吹打6孔板壁，尽量使细胞完全裂解；

5)转移细胞裂解液至1.5ml DEPC处理过的EP管中，置于冰上。加入0.2m1氯仿，剩余操作步骤同血液中RNA提取过程。

3、逆转录

具体步骤同实施例2.

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2所示，与正常肝细胞系相比，WFDC21P基因在肝癌细胞HepG2、Huh7中表达均上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例4WFDC21P基因的沉默

1、细胞培养

人肝癌细胞株HepG2，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、siRNA设计

针对WFDC21P基因的siRNA序列：

阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：

正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.6)，

反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.7)；

siRNA1-WFDC21P：

正义链：5’-UCAACUUCAGUCAAUAGAGGU-3’(SEQ ID NO.8)，

反义链：5’-CUCUAUUGACUGAAGUUGACA-3’(SEQ ID NO.9)；

siRNA2-WFDC21P：

正义链：5’-AUCCUUAAGAUAACUCUUCAU-3’(SEQ ID NO.10)，

反义链：5’-GAAGAGUUAUCUUAAGGAUCA-3’(SEQ ID NO.11)；

siRNA3-WFDC21P：

正义链为5’-ACGAUCUUAGGGAAAGAUGAU-3’(SEQ ID NO.12)，

反义链为5’-CAUCUUUCCCUAAGAUCGUCA-3’(SEQ ID NO.13)

将细胞按2×10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h；

在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。

实验分为空白对照组(HepG2)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1-WFDC21P、siRNA2-WFDC21P、siRNA3-WFDC21P)，其中阴性对照组siRNA与WFDC21P基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。

3、QPCR检测WFDC21P基因的转录水平

3.1细胞总RNA的提取

具体步骤同实施例3。

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3QPCR扩增步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，干扰WFDC21P基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图3显示，相比HepG2、转染空载siRNA-NC、siRNA1-WFDC21P、siRNA3-WFDC21P组，siRNA2-WFDC21P组能够显著降低WFDC21P的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5CCK8检测细胞增殖实验

1、细胞培养与转染步骤同实施例4

2、CCK8检测细胞增殖

1)将对数增殖期的HepG2细胞接种于96孔板，每孔2×10³个细胞；

2)实验分三组，分别是空白对照组、转染siRNA-NC组和转染siRNA2-WFDC21P，每组设6个复孔；

3)分别在转染0h、24h、48h、72h后加入10μl/孔CCK8试剂；

4)2h后使用酶标仪检测A450的吸光值。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

图4所示的结果显示：空白对照组同空载组无明显差异，而转染siRNA2-WFDC21P组的细胞生长速度明显低对照组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明WFDC21P的表达能够促进肝癌细胞的生长。

实施例6软琼脂克隆形成实验

1、用0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，轻轻吹打使之成为单细胞悬液，离心收集细胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，适当稀释后计数，调整细胞浓度为5×10³个/ml。

3、制备两个浓度分别为1.2％和0.7％的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃水浴中。

4、1.2％的琼脂糖和2×DMEM培养基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直径6cm平皿中放置5min冷却凝固，作为底层琼脂置于CO₂温箱中备用。

5、在无菌试管中1:1混合0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基，再向管中加入0.2ml浓度为5×10³个/ml的稳定感染细胞悬液，充分混匀，注入上述平皿中，逐渐形成双琼脂层，每个实验组重复4个样本。

6、待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO₂温箱中培养，每3天加培养基1.5ml。

7、培养14天后取出培养皿，用1ml浓度为0.005％的龙胆紫染色90min。把平皿放置在倒置显微镜下观察，每组细胞随机选取10个低倍视野，镜下技术形成的细胞克隆数。

8、结果

结果如图5所示，与对照组相比，转染siRNA2-WFDC21P的细胞组单细胞克隆集落形成数显著降低。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 王冬国

<120> WFDC21P在肝癌诊治中的应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 630

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

gggggaagaa gaaaagagga tgccagtcct tgttcctagg ccaagacctg agccctgtaa 60

tattaatatt tggatctaaa atcagccttc caacagcaac atgaagttgg cagccttcct 120

cctcctgtga tcctcatcat cttcagccta gaggtacaag agcttcaggc tgcaggagac 180

cggcttttgg gtgtctgacc cttctcaaca cagcatcaga cagccacctc tattgactga 240

agttgacaat ggagaataaa actcattacc cctgctgaat ccaggggccc ctttttacag 300

atgagaaaag ttccagaaag acccagagac ataatcaggt acctgcgtcg agctctgcac 360

aggtgactgg gactgcaacc ccggagacca ctgtgtcagc aatgggtgtg gccatgagtg 420

tgttgcagga tgaagagtta tcttaaggat catctttccc taagatcgtc atcccttcct 480

ggagttccta tcttccaaga tgtgactgtc tggagttcct tgactaggaa gatggatgaa 540

aacagcaagc ctgtggatgg agactacagg ggatatggga ggcagggaag aggggttgtt 600

tcttttaata aatcatcatt gttaaaagca 630

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctattgact gaagttgac 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attatgtctc tgggtctt 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgggaaact gtggcgtgat gg 22

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

ucaacuucag ucaauagagg u 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

cucuauugac ugaaguugac a 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

auccuuaaga uaacucuuca u 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaagaguuau cuuaaggauc a 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

acgaucuuag ggaaagauga u 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

caucuuuccc uaagaucguc a 21