禾谷镰孢的特异性PCR扩增引物及检测体系与应用的制作方法

本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的特异性PCR扩增引物及检测体系、含有该引物的试剂盒及其应用。

背景技术：

玉米是我国最重要的粮食作物之一，随着食品工业和饲料产业的发展，玉米作为主要食品和饲料作物的地位也日益上升。穗腐病是玉米生产上的重要病害，由多种病原真菌引起，不仅直接造成玉米产量损失，而且籽粒中的致病菌还能够产生多种真菌毒素，如单端孢霉烯、伏马毒素和玉米赤霉烯酮等，导致玉米品质下降，给食品与饲料带来重大的安全隐患，威胁到人畜健康。

镰孢菌(Fusarium spp.)是玉米生产上常见的病原真菌类群之一，能够在玉米的根、茎、叶、果上引发严重的病害，造成巨大的经济损失。大量研究表明，镰孢菌是引起玉米穗腐病最重要的病原菌，此外，还会引起玉米的茎腐病、鞘腐病、顶腐病、根腐病、苗枯病等病害。主要致病镰孢种包括禾谷镰孢复合种、拟轮枝镰孢、层出镰孢、尖镰孢复合种、黄色镰孢、木贼镰孢等。研究发现，美国、加拿大、德国、奥地利、尼泊尔、巴西、阿根廷等地的玉米穗腐病致病镰孢主要为禾谷镰孢复合种，而加拿大、德国、巴西、阿根廷、法国、意大利、尼罗地亚、尼泊尔、南非、伊朗等地的致病镰孢主要为拟轮枝镰孢，层出镰孢则主要分布在德国、巴西、尼泊尔以及阿根廷西北部。在我国，禾谷镰孢复合种主要分布于山西、陕西、甘肃、云南、贵州、东北及黄淮地区，拟轮枝镰孢主要分布于东北、北京、河北、河南、山东、安徽、四川、湖南、湖北等地，其他致病种也有少量分布。由此可见，禾谷镰孢分布地区较广，是许多地区玉米穗腐病的优势致病菌。

由于镰孢菌在自然界中分布非常广泛，种类多，形态变异大，而传统镰孢菌分离以形态学上差异划分组、种，以不同寄主或不同品种的致病力差异作为专化型或生理小种的鉴定手段，给镰孢菌的识别和鉴定工作带来了一定的困难。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，PCR技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与预警，对于镰孢种属的概念在认识上发生了很大变化，对镰孢菌分类更接近于自然亲缘关系，因此，开发不同镰孢种特异的分子标记，对于准确鉴定镰孢种具有较大的应用价值。

β微管蛋白(β-tubulin)基因广泛存在于真核生物中，目前尚无针对该靶基因设计的特异性禾谷镰孢检测引物的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可快速、准确地检测禾谷镰孢的特异性PCR扩增引物和检测体系以及含有该引物的试剂盒。

本发明的另一目的是提供上述引物及试剂盒在检测禾谷镰孢中的应用。

为了实现本发明目的，本发明从Fusarium Center's database at Penn State数据库中下载禾谷镰孢(F.graminearum)的β微管蛋白(β-tubulin)基因序列(KM373925.1)，分析了禾谷镰孢与其他镰孢种在β-tubulin基因序列上的差异(图1)，发现了数个高度特异且只存在于禾谷镰孢中的位点，利用Primer 5软件设计出一系列用于特异检测禾谷镰孢的引物，从中筛选出特异性最强的引物Fg18TF/Fg18TR，并设计了巢式外引物HW18TF/HW18TR来提高灵敏度。在此基础上建立了检测禾谷镰孢的PCR反应体系。

本发明提供的禾谷镰孢特异性PCR扩增引物，包括(Seq ID No:1-4)：

正向引物Fg18TF：5’-TTGTAAGTGTTTTCCTCTGACCT-3’

反向引物Fg18TR：5’-AGAAAGCAGCACCGATTTGG-3’；以及

正向巢式外引物HW18TF：5’-AACATGCGTGAGATTGTAAGTG TT-3’

反向巢式外引物HW18TR：5’-TAAACACCATTGCTGTCGAGA-3’

本发明还提供含有上述PCR引物的用于检测禾谷镰孢的试剂盒。

前述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。

本发明还提供上述PCR引物或试剂盒在检测禾谷镰孢中的应用，包括以下步骤：

1)提取样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用引物Fg18TF和Fg18TR进行单轮PCR扩增反应；或者，

当模板DNA浓度过低导致无法扩增出条带时，采用巢式PCR；先利用巢式外引物HW18TF和HW18TR进行第一轮PCR扩增反应，然后取1～2μL扩增产物作为模板，利用引物Fg18TF和Fg18TR进行第二轮PCR扩增反应；

3)分析PCR扩增产物。

前述的PCR反应体系为：1U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR反应缓冲液1.0μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μmol/L正向、反向引物各0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 6.25μL。

进行单轮PCR扩增反应以及巢式PCR中第二轮PCR扩增反应，所采用的反应程序为：94℃5min；95℃50s，58℃50s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

巢式PCR中第一轮PCR扩增反应，所采用的反应程序为：94℃5min；95℃50s，56℃50s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

对上述PCR扩增产物进行1～2％琼脂糖凝胶电泳，如果电泳检测结果出现大小约为291bp的特征条带，则表明样品中含有禾谷镰孢。

本发明所述样品为含有禾谷镰孢的菌丝、分生孢子的样品。

本发明还提供禾谷镰孢的特异性PCR检测体系，包括：1U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR反应缓冲液1.0μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μmol/L正向、反向引物各0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 6.25μL。

本发明基于禾谷镰孢与其他镰孢种的β微管蛋白(β-tubulin)基因序列差异，设计出可快速检测禾谷镰孢的特异性PCR引物，并在此基础上建立了PCR快速检测体系，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境快速、准确地检测出禾谷镰孢。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，可对禾谷镰孢的各种形态的繁殖体如菌丝、分生孢子等进行检测，对禾谷镰孢疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。

附图说明

图1为本发明禾谷镰孢与其他镰孢种的β-tubulin基因序列部分比对结果。

图2为本发明实施例2中利用引物Fg18TF/Fg18TR进行PCR扩增的结果；其中，1：尖镰孢；2：层出镰孢；3：黄色镰孢；4：茄镰孢；5：禾谷镰孢；6：拟轮枝镰孢；7：变红镰孢；8：藤仓镰孢；9：腐霉菌；10：青霉菌；11：黄曲霉菌；12：木霉菌，M为100bp DNA Ladder。

图3为本发明实施例2中引物Fg18TF/Fg18TR的PCR扩增反应体系灵敏度检测结果，其中，1-8分别代表DNA样品经10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷与10⁸倍稀释，M为100bp DNA Ladder。

图4为本发明实施例2中利用巢式外引物HW18TF/HW18TR和引物Fg18TF/Fg18TR进行两轮PCR扩增反应体系灵敏度检测结果，其中，1-8分别代表DNA样品经10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷与10⁸倍稀释，M为100bp DNA Ladder。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1用于检测禾谷镰孢的特异性PCR引物的合成

从Fusarium Center's database at Penn State数据库中下载禾谷镰孢的β微管蛋白(β-tubulin)基因序列(KX087134.1)，利用DNAMAN等生物学软件对禾谷镰孢和其他镰孢种的β-tubulin基因序列进行比对分析，发现了数个高度特异且只存在于禾谷镰孢中的位点，利用软件Primer 5设计出一系列检测禾谷镰孢的引物，从中筛选出特异性、灵敏性最强的引物Fg18TF/Fg18TR(表1)，巢式外引物HW18TF/HW18TR(表2)并在此基础上建立了检测禾谷镰孢的PCR反应体系。

表1禾谷镰孢特异性PCR检测引物Fg18TF/Fg18TR信息

表2巢式PCR外引物HW18TF/HW18TR信息

引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成。

PCR反应体系为：1U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR反应缓冲液1.0μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μmol/L正向、反向引物各0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 6.25μL。

单轮PCR扩增反应所采用的反应程序为：94℃5min；95℃50s，58℃50s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

当模板DNA浓度过低导致无法扩增出条带时，采用巢式PCR。

巢式PCR的反应程序为：

第一轮PCR扩增反应：94℃5min；95℃50s，56℃50s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

第二轮PCR扩增反应：94℃5min；95℃50s，58℃50s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

实施例2利用PCR引物Fg18TF/Fg18TR和HW18TF/HW18TR检测禾谷镰孢的特异性和灵敏度分析

1.1样本来源：

本实施例中采用的病原菌包括尖镰孢、禾谷镰孢、黄色镰孢、茄镰孢、层出镰孢、拟轮枝镰孢、变红镰孢、藤仓镰孢、腐霉菌、青霉菌、黄曲霉菌、木霉菌，均由中国农业科学院作物科学研究所提供。

1.2镰孢菌基因组DNA提取：

将经单孢分离的不同镰孢菌分离物分别转移到不同PDA培养基上，25℃培养7d，刮取菌丝晾干后装于2.0mL离心管中。用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(上海生工)提取DNA。经琼脂糖凝胶电泳和UV-VIS spectrophotometer Q5000紫外-可见分光光度计(Quawell，USA)双重检测其含量和纯度，于-20℃保存备用。

1.3样品DNA的梯度稀释：

用UV-VIS spectrophotometer Q5000紫外-可见分光光度计(Quawell，USA)检测上述提取的禾谷镰孢样品的DNA浓度，为1089μg/mL。将DNA样品进行10倍梯度稀释，共稀释8次，最高稀释至10⁸倍，于-20℃保存备用。

1.4PCR扩增反应：

扩增反应在Biometra T3000热循环仪中进行。PCR反应体系及反应程序同实施例1所述。

1.5结果：

反应结束后，将2μL上样缓冲液(pH8.0的10mmol/L EDTA、98％去离子甲酰胺、0.025％二甲苯青FF)与PCR扩增产物充分混合，取5μL在加有核酸染料的1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电压为50-100V，30min后在凝胶成像系统下观察记录，根据100bp DNA Ladder估测条带大小。电泳检测结果如图2所示，泳道5为禾谷镰孢样品，能扩增出约291bp的特征条带，而其他镰孢种中未出现扩增条带。上述结果表明引物Fg18TF/Fg18TR的特异性强，利用该引物能将禾谷镰孢与其他真菌明显区分开来。

分别以上述8个浓度梯度稀释的DNA样品为模板进行单轮PCR扩增反应。PCR扩增程序和扩增产物检测方法同上。结果如图3所示，当稀释至100倍时，条带不明显。因此，该引物对的灵敏度可达100μg/mL，检测灵敏度相对较低。

分别以上述8个浓度梯度稀释的DNA样品为模板利用巢式PCR引物HW18TF/HW18TR先进行一轮PCR扩增，再取1μL反应产物进行第二轮PCR扩增，PCR扩增程序和扩增产物检测方法同上。结果如图4所示，当稀释至10⁸倍时，条带不明显。因此，利用巢式PCR可将引物灵敏度提升至100fg/mL，检测灵敏度非常高。

利用本发明的PCR反应体系，可对不同禾谷镰孢染病样品进行定性分子检测，应用该方法可准确预测大田禾谷镰孢消长动态和疫情发展趋势，便于及时确定病害最佳防控时期，阻断源头病菌的繁殖与蔓延，达到高效治理禾谷镰孢病害的目的。随着PCR技术的普及，应用PCR技术检测病害比起传统的形态学鉴定方法其操作更加的简单，快速，成本低。且本发明利用了巢式PCR，其灵敏度达到了100fg/mL，相对于ZL201410456539.8基于LAMP方法检测的下限为100pg，本方法检测的灵敏度提高了1000倍，可广泛用于检测更低浓度的病原菌。

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增完整的片段，由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式PCR扩增有效避免了第二轮PCR产物因引物配对特异性不强而造成的非特异性扩增现象，因此巢式PCR特异性非常强。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 禾谷镰孢的特异性PCR扩增引物及检测体系与应用

<130> KHP171111649.1TQ

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgtaagtgt tttcctctga cct 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agaaagcagc accgatttgg 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacatgcgtg agattgtaag tgtt 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taaacaccat tgctgtcgag a 21