焦磷酸测序法快速检测CYP2D6基因拷贝数的试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于分子诊断
技术领域：
，具体涉及一种焦磷酸测序法快速检测CYP2D6基因拷贝数的试剂盒及其应用。
背景技术：
：人细胞色素P450(cytochromeP450s，CYP)是由许多同工酶组成的超大家族，主要位于肝微粒体中，参与生物体内源性和外源性物质的生物转化，在调节机体与外界环境的相互作用以及保持机体内环境稳定中起重要作用。目前已知人类的P450有三十多种，重要的有七种，CYP2D6即是其中的一种。CYP2D6又称异喹胍4-羟化酶，最早于1984年从快代谢者肝脏微粒体中提纯获得，主要分布于肝脏、小肠和脑组织中，仅占CYP450酶系总量的2％，但是临床上约25％的药物由其催化代谢，且有着高度的基因多态性。CYP2D6等位基因多态性可使酶呈现不同的活性，即决定了其表型的多样性，其表型大致可分为4种：慢代谢(poormetabolism，PM)型、中间代谢(intermediatedmetabolism，IM)型、快代谢(extensivemetabolism，EM)型和超快代谢(ultrametabolism，UM)型。其中CYP2D6基因拷贝数可以引起重要的代谢类型多态性，功能型等位基因(*1、*2、*35)拷贝数(基因拷贝数大于2，如*1×2/*1或*1×2/*2×2的表达可以引起酶活性增加，携带这类基因的个体CYP450酶活性高，被称为超快代谢者。携带非功能型或功能下调型的等位基因拷贝数的个体酶活性并未增加。若缺失这个基因，这类基因的个体酶活性降低，被称为慢代谢者。通过对肝脏CYP2D6基因拷贝数的检测，可预知侯选药物在体内的药代动力学特性及其代谢物，而研究这些代谢物的活性和毒性，也将有助于我们寻找更为安全、合理和有效的CYP2D6酶系统氧化代谢多态性的遗传分子机制不仅具有深远的理论意义，同时也具有重要的实际临床应用价值。但是由于目前用于CYP2D6基因拷贝数的检测方法成本高、可靠性低，使得很多研究者心有余力不足，同时迫于经济原因，基因检测用于个体化治疗的开展进展缓慢。焦磷酸测序技术为短片段DNA快速测序技术，不同于传统的测序方法。它无需制胶电泳，也无需荧光染色和同位素，操作简便，需时少，成本低，一次最多可检测96个样本。既可对样本进行短片段测序，又可进行单核苷酸(SNP)分析，结果简单易读。本专利采用PCR扩增和焦磷酸测序技术结合，先用PCR扩增出CYP2D6基因相关目的片段，再通过设计测序引物，运用焦磷酸测序技术检测其拷贝数，建立一种快速、准确、高灵敏度和高通量的药物代谢预测的分子诊断方法。技术实现要素：本发明需要解决的技术问题是，提供一种操作简便、成本低廉、快捷、准确的检测CYP2D6基因拷贝数的试剂盒。本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒在检测CYP2D6基因拷贝数中的应用。为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：检测CYP2D6基因拷贝数的引物，包括如下引物：(1)扩增CYP2D6基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；其中，下游引物的5’端用生物素标记；(2)CYP2D6基因拷贝数的测序引物：其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。一种检测CYP2D6基因拷贝数的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：(1)DNA提取试剂；(2)反应液：PCR缓冲液，SEQIDNO：1～2所示的PCR引物10μmol/L，MgCl225mmol/L，dNTPs10mmol/L，TaqDNA聚合酶5U/μL，甘油；(3)单链纯化试剂：体积分数为75％乙醇水溶液，0.2mol/LNaOH，10mmol/LpH7.6Tris-Acetate溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；(4)测序试剂：DNA聚合酶，SEQIDNO：3所示的测序引物；ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。其中，所述的结合缓冲液包括：10mMTris-HCl、2MNaCl、1mMEDTA、0.1％(v/v)Tween20。其中，所述的退火缓冲液包括：pH7.620mMTris-Acetate、2mM醋酸镁。上述检测CYP2D6基因拷贝数的试剂盒在利用焦磷酸测序技术检测CYP2D6基因拷贝数中的应用在本发明中的应用。一种焦磷酸测序法检测CYP2D6基因拷贝数的方法，该方法包括如下步骤：(1)提取标本组织中的基因组DNA；(2)以步骤(1)中所得基因组DNA为模板，SEQIDNO：1～2所示的核苷酸序列为引物，PCR扩增CYP2D6基因相关片段；(3)将步骤(2)得到的基因片段与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；(5)测序结果分析。步骤(2)中，所述的PCR扩增：PCR体系为50μL，其中DNA模板2μL，10×PCRbuffer5μL，MgCl24μL，dNTP3μL，上下游引物每对各取0.15μL混合于一管，TaqDNA聚合酶0.3μL，甘油2.5μL，加水补充至50μL；PCR条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。CYP2D6基因是一个完整的功能基因，可表达有功能的蛋白质，基因全长为7kb，含有9个外显子和8个内含子，编码碱基序列全长1491bp，共编码497个氨基酸。而编码CYP2D6的基因位于第22号染色体长臂q13.1CYP2D6-8基因簇，与CYP2D7P和CYP2D8P假基因连锁，共存于29kb的片段中。CYP2D6、CYP2D7、CYP2D8它们三者之间具有高度同源性，尤其CYP2D7基因与CYP2D6基因有97％的核酸序列同源性。由于CYP2D7在体内也存在着拷贝数，而CYP2D8只存在着1个拷贝且比较稳定，因此本专利利用焦磷酸测序方法，将CYP2D8作为对照，通过设计测序引物用来检测CYP2D6的拷贝数，设计原理如图所示：首先查找出CYP2D6与CYP2D8的共同部分序列，但区别于CYP2D7的序列设计引物，通过PCR可以同时将CYP2D6与CYP2D8基因相关片段进行扩增，而后将PCR扩增产物用于焦磷酸测序，通过焦磷酸测序同时测出CYP2D6与CYP2D8基因的部分序列，由于所测序列不完全相同，CYP2D8的碱基有别于CYP2D6中的碱基，且CYP2D8只存在着1个拷贝，因此可以将CYP2D8基因与CYP2D6基因所测序列中同一位置处不同碱基的峰高比值作比较，比如将CYP2D8基因所测序列中的碱基G与CYP2D6中的碱基AT的峰高比值作比较，从而得出CYP2D6的拷贝数。引物设计原理见图5。本发明的有益效果：(1)本发明所涉及的引物扩增出的出片段在100bp左右，大大提高了标本提取DNA后PCR的扩增效率。(2)本发明所涉及的测序引物将CYP2D6与CYP2D8的不同碱基明显区分开，且容易计算出两者的比率。(3)本发明采用的焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。总之，本发明提供了一种焦磷酸测序技术检测CYP2D6基因拷贝数检测试剂盒及其应用。应用焦磷酸测序技术可以快速准确检测CYP2D6基因拷贝数，可广泛应用于临床上个体化医疗方案制定及预防。与现有技术相比，其应用在个性化医疗上有较大的推广应用价值，也可以将该平台运用于其他疾病相关基因多态性检测。附图说明图1为本发明CYP2D6基因缺失的焦磷酸测序的结果图。图2为本发明CYP2D6基因1个拷贝的焦磷酸测序的结果图。图3为本发明CYP2D6基因2个拷贝的焦磷酸测序的结果图。图4为本发明CYP2D6基因3个拷贝的焦磷酸测序的结果图。图5引物设计原理。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1：试剂。(1)DNA提取试剂：购自QIAGEN公司。(2)反应液：PCRBuffer：购自美国Fermentas公司；引物SEQIDNO：1～2，由上海英俊生物科技有限公司合成；MgCl2：购自美国Fermentas公司；0.2mMdNTPs：购自美国Fermentas公司；2U/μLTaqDNA聚合酶：购自美国Fermentas公司。(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液：购于杭州长征化学试剂有限公司；0.2mol/LNaOH：购于上海试四赫维化工有限公司；10mmol/LTris-Acetate(pH7.6)：Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司；结合缓冲液：由10mMTris-HCl(Tris-base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化学试剂有限公司)，2MNaCl(购于上海试四赫维化工有限公司)，1mMEDTA(购于杭州化学试剂有限公司)，0.1％(v/v)Tween20(购于美国Sigma公司)组成；退火缓冲液：由20mMTris-Acetate(pH7.6)(Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组成；亲和素标记的磁珠(购于GEhealthcareBioscienceAB)。(4)测序试剂：测序引物SEQIDNO：3，由上海英俊生物科技有限公司合成；DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶：购于QIAGEN公司；底物APS和荧光素：购于QIAGEN公司；四种dNTP(dATPS，dTTP，dCTP，dGTP)：购于QIAGEN公司。实施例2：检测方法。仪器：Bio-RadS1000PCR仪，BeckmanMicrofuge22R台式微量冷冻离心机，QIAGENPyroMarkQ96ID测序仪。(1)提取全血标本中的DNA：参考公开的文献，采用相应的商品化DNA抽提试剂盒，按照试剂盒说明书制备血液中基因组DNA，作为PCR反应模板备用。DNA溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/uL视为合格，保存核酸标本至4℃冰箱；(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；其中，PCR扩增采用50μl体系，其中DNA模板2μL，10×PCRbuffer5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTP(10mmol/L)3μL，10μmol/L浓度上下游引物(SEQIDNO：1-6)各取0.15μL混合于一管，Taq酶(5U/μL)0.3μL，甘油2.5μL，加水补充至50μL。反应条件94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化：A.在使用前，保证所有溶液都达到室温；B.在PSQ96板中加入45μLannealingbuffer，然后每孔加入测序引物SEQIDNO：3(10uM)1uL；C.使用Vertex混匀Sepharosebeads,将需要使用的sepharoebeads总量(每样本3μL)转移到一个Eppendorf管中，在sepharosebead中加入bindingbuffer，使得平均每个样品约有50μL的体积，将混合物混匀；D.将以上混合物加入PCR产物(50μL反应体积)中，每样本50μL，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合；E.在Vacuumprepworkstation中，四个样品板中依次加入180mL高纯水、70％乙醇、washingbuffer和120mlDenaturationbuffer；F.打开vacuumprepworkstation的泵，将vacuumpreptool在高纯水中清洗30秒,然后将vacuumpreptool移到PCR板中，抓取sepharosebeads，将vacuumpreptool放入70％乙醇中5秒，然后移到denatureationbuffer中5秒，再移到washingbuffer中清洗10秒，把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，将vacuumpreptool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharosebeads；G.使用高纯水清洗vacuumpreptool。H.将放有样品的PSQ96板放在ThermoPlate上加热到80℃2分钟，再冷却到室温后放入测序仪中。(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；(5)测序结果根据CYP2D6与CYP2D8中不同碱基的峰高比来判断CYP2D6基因的拷贝数。将本发明所述的试剂盒用于抽取50例临床患者血液样本的核酸，检测所述的CYP2D6基因拷贝数，检测结果如下表：数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。因此我们采用数字PCR作为参考方法，分别对CYP2D6片段、CYP2D8片段设计引物，特异扩增CYP2D6片段及CYP2D8片段，并将CYP2D8片段作为内参基因，最后通过公式计算目的基因与内参基因的拷贝数比值得到拷贝数。将检测结果统计如下表：拷贝数人数(总人数＝50)频率cyp2d6x012.00％cyp2d6x11836.00％cyp2d6x22754.00％cyp2d6x348.00％如图1～4所示，图1中T含量为0，故为CYP2D6片段缺失；图2T/G比值约为1，为1个拷贝；图3T/G比值约为2，为2个拷贝；图4T/G比值约为3，为3个拷贝。将50例标本进行统计分析，CYP2D6的拷贝数中以2个拷贝的居多，有27例，占54.17％；其次为1个拷贝，有18例，占37.50％；3个拷贝的有4例，占8.33％；缺失的有1例，占2％；未检测到3个拷贝数以上的。与数字PCR检测结果相比，其符合率达100％。综上所述，焦磷酸测序是一种准确、可靠及高通量的检测技术，15分钟可检测96个样品，并可同时测定多态性位点附近的多个碱基。本试剂盒建立的单管PCR-Pyrosequencing检测CYP2D6基因的拷贝数，更具有节省操作时间与成本的优势；结合CYP2D6基因多态性的位点检测，能对患者起到指导用药的作用，在个性化医疗上有很大的推广价值。可以将该平台运用于其他疾病相关的基因诊断上。SEQUENCELISTING<110>杭州迪安医学检验中心有限公司<120>焦磷酸测序法快速检测CYP2D6基因拷贝数的试剂盒及其应用<130>SG20161222001<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>扩增CYP2D6基因上游引物<400>1gtggtggctgacctgttct19<210>2<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>扩增CYP2D6基因下游引物<400>2gggctcacgctgcacatc18<210>3<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>CYP2D6基因拷贝数的测序引物<400>3gtggtggctgacctgttct19当前第1页1 2 3