一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物及方法与流程

本发明属于分子生物学检验领域，具体涉及一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及方法。
背景技术：
：焦磷酸测序(pyrosequencing)是一种聚合原理的dna测序(即，确定dna中核苷酸的顺序)方法，属于新一代dna序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dntp，若该dntp与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(ppi)，ppi可最终转化为可见光信号，并由pyrogramtm转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dntp，继续dna链的合成；最后通过分析岀峰值的情况，达到测定dna序列的目的。华法林是一种双香豆素衍生物，是目前临床上应用最广泛的口服抗凝药物之一，用于预防和治疗深静脉血栓、肺栓塞、心脏瓣膜置换术及房颤导致的血栓形成。但华法林的稳定剂量在人群中存在明显个体差异，正确估算不同个体华法林的安全、有效治疗剂量有助于降低过度抗凝和出血的风险。遗传因素是影响华法林用量个体差异的主要因素，其中维生素k环氧化物还原酶复合体亚单位1基因(vitaminkepoxidereductasecomplexsubunit1，vkorc1)和细胞色素p4502c9基因(cytochromep4502c9，cyp2c9)是影响华法林个体剂量差异的最主要原因。vkorc1-1639g>a基因位点存在多态性，与华法林剂量和疗效密切相关。与野生型等位基因cyp2c9*1相比，cyp2c9430c>t和cyp2c91075a>c变异所对应的等位基因cyp2c9*2和cyp2c9*3导致酶活性降低，从而使华法林代谢减慢，易出现出血等不良反应。在用药前对vkorc1和cyp2c9基因进行分型，可帮助病人预测华法林的维持剂量。对vkorc1-1639g>a、cyp2c9430c>t和cyp2c91075a>c3个位点的基因分型有助于华法林个体化治疗。目前对这3个snp位点的分型方法可以分为两类：一类是单链构象多态性(sscp)、变性梯度凝胶电泳(ddge)、酶切扩增多态性序列(caps)、等位基因特异性pcr(as-pcr)等传统的检测方法。另一类是直接测序、dna芯片、变性高效液相色谱(dhplc)、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线(hrm)等新技术。传统方法对设备要求不高、成本低，但检测速度慢，很难实现高通量的检测；新方法能实现高通量、自动化检测，但对设备和技术要求高，成本较高。技术实现要素：针对以上技术问题，本发明提供一种可对vkorc1和cyp2c9基因进行快速、准确和批量检测的焦磷酸测序法检测vkorc1和/或cyp2c9基因多态性的方法。本发明的技术方案方案为：一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物，所述vkorc1检测的多态位点为vkorc1-1639g>a，所述cyp2c9检测的多态位点为cyp2c9430c>t和/或cyp2c91075a>c，所述引物包括：(1)vkorc1-1639g>a基因的扩增引物为：上游引物：5’-tgttggccaggcttgtcttaaact-3'下游引物：5’-tgggaagtcaagcaagagaagacc-3'vkorc1-1639g>a基因的测序引物为：5’-gcgtgagccaccgca-3'(2)cyp2c9430c>t基因的扩增引物为：上游引物：5’-ctcatgacgctgcggaatttt-3'下游引物：5’-ccacccttggtttttctcaactc-3'cyp2c9430c>t基因的测序引物为：5’-gggcttcctcttgaac-3'(3)cyp2c91075a>c基因的扩增引物为：上游引物：5’-ccaggaagagattgaacgtgtga-3'下游引物：5’-tttggggacttcgaaaacatg-3'cyp2c91075a>c基因的测序引物为：5’-cacgaggtccagagatac-3'进一步的，所述vkorc1-1639g>a基因下游引物的5’端、cyp2c9430c>t基因的上游引物的5’端、cyp2c91075a>c基因下游引物的5’端标记有生物素。一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的方法，包括以下步骤：s1：标本采集及dna提取：抽取受试者外周静脉血2ml，使用edta-na2抗凝，并取全血200μl，用dna提取试剂盒提取基因组dna，经核酸蛋白分析仪进行dna纯度和浓度检测后于-20℃保存备用；s2：pcr扩增反应：采用一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物，具体引物名称及序列、pcr扩增反应体系、pcr扩增反应条件如表1、表2、表3所示：表1扩增及测序引及扩增片段长度所述f为上游引物、r为下游引物、s为测序引物、bio为生物素标记；表2pcr扩增反应体系表3pcr扩增反应条件s3：pcr产物凝胶电泳分析：制备2％的琼脂糖凝胶，在所述琼脂糖凝胶中加入2μlpcr产物，在电压110v，电流400ma的条件下电泳40min，在凝胶成像仪上观察目的条带电泳结果；s4：焦磷酸测序：配制所述测序引物退火缓冲液，固定所述pcr产物，使得所述琼脂糖凝胶与经所述生物素标记的pcr产物充分结合，在真空工作站中制备成单链dna模板，之后在pyromarkq24试剂仓中依次对应加入dntp、底物和酶混合物，在pyromarkq24软件上设置测序运行程序，并将所述试剂仓和24孔测序孔放入pyromarkq24中进行焦磷酸测序，15min测序结束后在同一软件读取结果并分析。进一步的，s4中所述酶混合物为dna聚合酶、atp硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶。进一步的，s1中所述dna提取试剂盒包括裂解缓冲液、吸附剂、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠3-6％、柠檬酸钠0.3-0.8％、变性剂2-5％、还原剂0.05-0.2％、乙二胺四乙酸0.5-1.5％、离子型表面活性剂2.2-2.7％、无水乙醇30-40％，余量为超纯水，所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和his-tag，所述乙二胺四乙酸和his-tag的摩尔百分比为1:10-20；所述吸附剂为纳米磁珠；所述洗脱缓冲液的为：0.5％氢氧化钠。更进一步的，所述变性剂为盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍中任意一种，变性剂可溶解蛋白质,导致细胞结构破坏,核蛋白二级结构破坏,从核酸上解离下来。更进一步的，所述还原剂为2-巯基乙醇(β-me)、二硫苏糖醇(dtt)、二硫赤藓糖醇、还原型的谷胱甘肽(gst)或半胱氨酸中任意一种，可保护蛋白质或酶中的疏基不至被氧化而失活。更进一步的，所述离子型表面活性剂为sds、dtac、ctab、cpb或opb中任意一种，表面活性剂与固定在电极表面的dna可通过静电和疏水性作用结合，从而改变dna在电极表面的状态，使电活性小分子mb的电化学行为发生变化。更进一步的，所述纳米磁珠为超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，直径为150-700nm，四氧化三铁具有优良的磁导性，石墨烯具有独特的二维结构和孔径分布，具有优异的吸附性能，二者采用化学沉淀法制备得到的四氧化三铁石墨烯复合材料水溶性较好且稳定性较强。更进一步的，所述dna提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：(1)将所述裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液分别调节ph至7.5-8、7.0-7.5和7.8-8.2之间，并分别通过0.45μm滤膜除菌，得到除菌后的裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，置于4至-20℃备用；(2)提取全血200μl放入样品管内；(3)在所述样品管内加入1.7-2.5ml所述除菌后的裂解缓冲液，放入到37-42℃水浴中充分反应；(4)加入所述超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，并充分混合，超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠的加入量为步骤(3)中所述除菌后的裂解缓冲液质量的7-10％；(5)将样品管放入离心机内，以10000-15000r/min转速离心1-2min,离心结束后弃掉上清液；(6)使用2-3ml所述漂洗缓冲液重悬，以10000-15000r/min转速离心1-3min,弃掉上清液，重复此步骤1-3次；(7)在25-30℃温度下干燥3-6min后，加入120-200μl所述洗脱缓冲液，在50-55℃水浴温度下溶解；(8)再使用离心机，以10000-15000r/min转速离心1-3min,取上清液，得到所述基因组dna。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明设计的基因多态性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。(2)本发明提供的检测方法检测的结果与sanger测序法检测结果完全一致，可以满足临床上对vkorc1和cyp2c9基因进行准确分型的要求。(3)本发明成功建立了基于焦磷酸测序技术的vkorc1和cyp2c9基因快速、准确的分型方法，可对这两个基因进行快速、批量的基因型检测，有助于临床上开展华法林个体化用药。(4)本发明提供的检测方法具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单、成本低并能有效满足临床检验要求的优点。附图说明图1是vkorc1-1639g>a基因型焦磷酸测序与sanger测序对比图，其中，图1-a是vkorc1-1639g>a位点其中一种基因型的焦磷酸测序图，图1-a是vkorc1-1639g>a位点其中一种基因型的sanger测序图；图1-b是vkorc1-1639g>a位点另一种基因型的焦磷酸测序图，图1-b是vkorc1-1639g>a位点另一种基因型的sanger测序图；图2是cyp2c9430c>t和cyp2c91075a>c基因型焦磷酸测序与sanger测序对比图，其中，图2-a是cyp2c9430c>t位点基因型的焦磷酸测序图，图2-a是cyp2c9430c>t位点基因型的sanger测序图；图2-b是cyp2c91075a>c其中一种基因型的焦磷酸测序图，图2-b是cyp2c91075a>c其中一种基因型的sanger测序图；图2-c是cyp2c91075a>c另一种基因型的焦磷酸测序图，图2-c是cyp2c91075a>c另一种基因型的sanger测序图。具体实施方式为便于对本发明的理解，下面结合附图和具体实施例做进一步的解释说明。实施例1一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物，所述vkorc1检测的多态位点为vkorc1-1639g>a，所述cyp2c9检测的多态位点为cyp2c9430c>t为cyp2c9430c>t和/或cyp2c91075a>c，所述引物包括：(1)vkorc1-1639g>a基因的扩增引物为：上游引物：5’-tgttggccaggcttgtcttaaact-3'下游引物：5’-tgggaagtcaagcaagagaagacc-3'vkorc1-1639g>a基因的测序引物为：5’-gcgtgagccaccgca-3'(2)cyp2c9430c>t基因的扩增引物为：上游引物：5’-ctcatgacgctgcggaatttt-3'下游引物：5’-ccacccttggtttttctcaactc-3'cyp2c9430c>t基因的测序引物为：5’-gggcttcctcttgaac-3'(3)cyp2c91075a>c基因的扩增引物为：上游引物：5’-ccaggaagagattgaacgtgtga-3'下游引物：5’-tttggggacttcgaaaacatg-3'cyp2c91075a>c基因的测序引物为：5’-cacgaggtccagagatac-3'其中，所述vkorc1-1639g>a基因下游引物的5’端、cyp2c9430c>t基因的上游引物的5’端、cyp2c91075a>c基因下游引物的5’端标记有生物素。一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的方法，包括以下步骤：s1：标本采集及dna提取：抽取受试者外周静脉血2ml，使用edta-na2抗凝，并取全血200μl，用dna提取试剂盒提取基因组dna，经核酸蛋白分析仪进行dna纯度和浓度检测后于-20℃保存备用；其中，所述dna提取试剂盒包括裂解缓冲液、吸附剂、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠3％、柠檬酸钠0.3％、盐酸胍2％、2-巯基乙醇(β-me)0.05％、乙二胺四乙酸0.5％、sds2.2％、无水乙醇30％，余量为超纯水，所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和his-tag，所述乙二胺四乙酸和his-tag的摩尔百分比为1:10；所述吸附剂为纳米磁珠，其中，所述纳米磁珠为超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，直径为150nm，四氧化三铁具有优良的磁导性，石墨烯具有独特的二维结构和孔径分布，具有优异的吸附性能，二者采用化学沉淀法制备得到的四氧化三铁石墨烯复合材料水溶性较好且稳定性较强；所述洗脱缓冲液的为：0.5％氢氧化钠。其中，所述dna提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：(1)将所述裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液分别调节ph至7.5、7.0和7.8，并分别通过0.45μm滤膜除菌，得到除菌后的裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，置于4℃备用；(2)提取全血200μl放入样品管内；(3)在所述样品管内加入1.7ml所述除菌后的裂解缓冲液，放入到37℃水浴中充分反应；(4)加入所述超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，并充分混合，超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠的加入量为步骤(3)中所述除菌后的裂解缓冲液质量的7％；(5)将样品管放入离心机内，以10000r/min转速离心1min,离心结束后弃掉上清液；(6)使用2ml所述漂洗缓冲液重悬，以10000r/min转速离心1min,弃掉上清液，重复此步骤1次；(7)在25℃温度下干燥3min后，加入120μl所述洗脱缓冲液，在50℃水浴温度下溶解；(8)再使用离心机，以10000r/min转速离心1min,取上清液，得到所述基因组dna。s2：pcr扩增反应：采用一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物，具体引物名称及序列、pcr扩增反应体系、pcr扩增反应条件如表1、表2、表3所示：表1扩增及测序引及扩增片段长度所述f为上游引物、r为下游引物、s为测序引物、bio为生物素标记；表2pcr扩增反应体系试剂体积mix12.5μlmgcl2(25mmol/l)1.5μlcoralloadconcentrate(10×)2.5μltaqdna聚合酶5μlprimera0.5μlprimerb0.5μldna模板2μl超纯水0.5μl总体积(μl)25μl表3pcr扩增反应条件s3：pcr产物凝胶电泳分析：制备2％的琼脂糖凝胶，在所述琼脂糖凝胶中加入2μlpcr产物，在电压110v，电流400ma的条件下电泳40min，在凝胶成像仪上观察目的条带电泳结果；s4：焦磷酸测序：配制所述测序引物退火缓冲液，固定所述pcr产物，使得所述琼脂糖凝胶与经所述生物素标记的pcr产物充分结合，在真空工作站中制备成单链dna模板，之后在pyromarkq24试剂仓中依次对应加入dntp、底物和酶混合物，其中，所述酶混合物为dna聚合酶、atp硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶。在pyromarkq24软件上设置测序运行程序，并将所述试剂仓和24孔测序孔放入pyromarkq24中进行焦磷酸测序，15min测序结束后在同一软件读取结果并分析。实施例2一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物，所述vkorc1检测的多态位点为vkorc1-1639g>a，所述cyp2c9检测的多态位点为cyp2c9430c>t为cyp2c9430c>t和/或cyp2c91075a>c，所述引物包括：(1)vkorc1-1639g>a基因的扩增引物为：上游引物：5’-tgttggccaggcttgtcttaaact-3'下游引物：5’-tgggaagtcaagcaagagaagacc-3'vkorc1-1639g>a基因的测序引物为：5’-gcgtgagccaccgca-3'(2)cyp2c9430c>t基因的扩增引物为：上游引物：5’-ctcatgacgctgcggaatttt-3'下游引物：5’-ccacccttggtttttctcaactc-3'cyp2c9430c>t基因的测序引物为：5’-gggcttcctcttgaac-3'(3)cyp2c91075a>c基因的扩增引物为：上游引物：5’-ccaggaagagattgaacgtgtga-3'下游引物：5’-tttggggacttcgaaaacatg-3'cyp2c91075a>c基因的测序引物为：5’-cacgaggtccagagatac-3'其中，所述vkorc1-1639g>a基因下游引物的5’端、cyp2c9430c>t基因的上游引物的5’端、cyp2c91075a>c基因下游引物的5’端标记有生物素。一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的方法，包括以下步骤：s1：标本采集及dna提取：抽取受试者外周静脉血2ml，使用edta-na2抗凝，并取全血200μl，用dna提取试剂盒提取基因组dna，经核酸蛋白分析仪进行dna纯度和浓度检测后于-20℃保存备用；其中，所述dna提取试剂盒包括裂解缓冲液、吸附剂、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠4％、柠檬酸钠0.6％、硫氰酸胍3.5％、二硫苏糖醇(dtt)0.12％、乙二胺四乙酸1％、dtac2.4％、无水乙醇35％，余量为超纯水，所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和his-tag，所述乙二胺四乙酸和his-tag的摩尔百分比为1:15；所述吸附剂为纳米磁珠，其中，所述纳米磁珠为超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，直径为420nm，四氧化三铁具有优良的磁导性，石墨烯具有独特的二维结构和孔径分布，具有优异的吸附性能，二者采用化学沉淀法制备得到的四氧化三铁石墨烯复合材料水溶性较好且稳定性较强；所述洗脱缓冲液的为：0.5％氢氧化钠。其中，所述dna提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：(1)将所述裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液分别调节ph至7.8、7.3和8.0，并分别通过0.45μm滤膜除菌，得到除菌后的裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，置于-10℃备用；(2)提取全血200μl放入样品管内；(3)在所述样品管内加入2.0ml所述除菌后的裂解缓冲液，放入到40℃水浴中充分反应；(4)加入所述超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，并充分混合，超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠的加入量为步骤(3)中所述除菌后的裂解缓冲液质量的8％；(5)将样品管放入离心机内，以12000r/min转速离心90s,离心结束后弃掉上清液；(6)使用2-3ml所述漂洗缓冲液重悬，以12000r/min转速离心2min,弃掉上清液，重复此步骤2次；(7)在28℃温度下干燥4min后，加入160μl所述洗脱缓冲液，在53℃水浴温度下溶解；(8)再使用离心机，以12000r/min转速离心2min,取上清液，得到所述基因组dna。s2：pcr扩增反应：采用一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物，具体引物名称及序列、pcr扩增反应体系、pcr扩增反应条件如表1、表2、表3所示：表1扩增及测序引及扩增片段长度所述f为上游引物、r为下游引物、s为测序引物、bio为生物素标记；表2pcr扩增反应体系表3pcr扩增反应条件其中，所述退火的反应温度分为56℃、51℃和51℃三个温度值，所述三个温度值分别对应vkorc1、cyp2c9*2和cyp2c9*3三个基因，针对不同的基因相应选择最适宜的退火反应温度，提高扩增效果。s3：pcr产物凝胶电泳分析：制备2％的琼脂糖凝胶，在所述琼脂糖凝胶中加入2μlpcr产物，在电压110v，电流400ma的条件下电泳40min，在凝胶成像仪上观察目的条带电泳结果；s4：焦磷酸测序：配制所述测序引物退火缓冲液，固定所述pcr产物，使得所述琼脂糖凝胶与经所述生物素标记的pcr产物充分结合，在真空工作站中制备成单链dna模板，之后在pyromarkq24试剂仓中依次对应加入dntp、底物和酶混合物，其中，所述酶混合物为dna聚合酶、atp硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶。在pyromarkq24软件上设置测序运行程序，并将所述试剂仓和24孔测序孔放入pyromarkq24中进行焦磷酸测序，15min测序结束后在同一软件读取结果并分析。实施例3一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物，所述vkorc1检测的多态位点为vkorc1-1639g>a，所述cyp2c9检测的多态位点为cyp2c9430c>t为cyp2c9430c>t和/或cyp2c91075a>c，所述引物包括：(1)vkorc1-1639g>a基因的扩增引物为：上游引物：5’-tgttggccaggcttgtcttaaact-3'下游引物：5’-tgggaagtcaagcaagagaagacc-3'vkorc1-1639g>a基因的测序引物为：5’-gcgtgagccaccgca-3'(2)cyp2c9430c>t基因的扩增引物为：上游引物：5’-ctcatgacgctgcggaatttt-3'下游引物：5’-ccacccttggtttttctcaactc-3'cyp2c9430c>t基因的测序引物为：5’-gggcttcctcttgaac-3'(3)cyp2c91075a>c基因的扩增引物为：上游引物：5’-ccaggaagagattgaacgtgtga-3'下游引物：5’-tttggggacttcgaaaacatg-3'cyp2c91075a>c基因的测序引物为：5’-cacgaggtccagagatac-3'其中，所述vkorc1-1639g>a基因下游引物的5’端、cyp2c9430c>t基因的上游引物的5’端、cyp2c91075a>c基因下游引物的5’端标记有生物素。一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的方法，包括以下步骤：s1：标本采集及dna提取：抽取受试者外周静脉血2ml，使用edta-na2抗凝，并取全血200μl，用dna提取试剂盒提取基因组dna，经核酸蛋白分析仪进行dna纯度和浓度检测后于-20℃保存备用；其中，所述dna提取试剂盒包括裂解缓冲液、吸附剂、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠6％、柠檬酸钠0.8％、异硫氰酸胍5％、二硫赤藓糖醇0.2％、乙二胺四乙酸1.5％、ctab2.7％、无水乙醇40％，余量为超纯水，所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和his-tag，所述乙二胺四乙酸和his-tag的摩尔百分比为1:20；所述吸附剂为纳米磁珠，其中，所述纳米磁珠为超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，直径为700nm，四氧化三铁具有优良的磁导性，石墨烯具有独特的二维结构和孔径分布，具有优异的吸附性能，二者采用化学沉淀法制备得到的四氧化三铁石墨烯复合材料水溶性较好且稳定性较强；所述洗脱缓冲液的为：0.5％氢氧化钠。其中，所述dna提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：(1)将所述裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液分别调节ph至8、7.5和8.2，并分别通过0.45μm滤膜除菌，得到除菌后的裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，置于-20℃备用；(2)提取全血200μl放入样品管内；(3)在所述样品管内加入2.5ml所述除菌后的裂解缓冲液，放入到42℃水浴中充分反应；(4)加入所述超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，并充分混合，超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠的加入量为步骤(3)中所述除菌后的裂解缓冲液质量的10％；(5)将样品管放入离心机内，以15000r/min转速离心2min,离心结束后弃掉上清液；(6)使用3ml所述漂洗缓冲液重悬，以15000r/min转速离心3min,弃掉上清液，重复此步骤3次；(7)在30℃温度下干燥6min后，加入200μl所述洗脱缓冲液，在55℃水浴温度下溶解；(8)再使用离心机，以15000r/min转速离心3min,取上清液，得到所述基因组dna。s2：pcr扩增反应：采用一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物，具体引物名称及序列、pcr扩增反应体系、pcr扩增反应条件如表1、表2、表3所示：表1扩增及测序引及扩增片段长度所述f为上游引物、r为下游引物、s为测序引物、bio为生物素标记；表2pcr扩增反应体系试剂体积mix12.5μlmgcl2(25mmol/l)1.5μlcoralloadconcentrate(10×)2.5μltaqdna聚合酶5μlprimera0.5μlprimerb0.5μldna模板2μl超纯水0.5μl总体积(μl)25μl表3pcr扩增反应条件其中，所述退火的反应温度分为56℃、51℃和51℃三个温度值，所述三个温度值分别对应vkorc1、cyp2c9*2和cyp2c9*3三个基因，针对不同的基因相应选择最适宜的退火反应温度，提高扩增效果。s3：pcr产物凝胶电泳分析：制备2％的琼脂糖凝胶，在所述琼脂糖凝胶中加入2μlpcr产物，在电压110v，电流400ma的条件下电泳40min，在凝胶成像仪上观察目的条带电泳结果；s4：焦磷酸测序：配制所述测序引物退火缓冲液，固定所述pcr产物，使得所述琼脂糖凝胶与经所述生物素标记的pcr产物充分结合，在真空工作站中制备成单链dna模板，之后在pyromarkq24试剂仓中依次对应加入dntp、底物和酶混合物，其中，所述酶混合物为dna聚合酶、atp硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶。在pyromarkq24软件上设置测序运行程序，并将所述试剂仓和24孔测序孔放入pyromarkq24中进行焦磷酸测序，15min测序结束后在同一软件读取结果并分析。试验例试验：受检者采用实施例2方法的检测结果1、试验对象来自贵州省人民医院的成人50例，其中男21例，女29例，平均年龄(35.7±9.7)岁。2、主要仪器与试剂pyromarkq24焦磷酸测序仪(德国qiagen公司)；veriti96-wellpcr扩增仪(美国aooliedbiosystems公司)；d3-milli-q超纯水机(美国merck公司)；核酸蛋白分析仪(德国eppendorf公司)；sepharosebeads(美国gehealthcare公司)；专用聚合酶链反应试剂和测序试剂(德国qiagen公司)。3、不同基因型测序结果根据待测位点出峰的碱基和峰高，可以清晰判断3个snp位点的基因型。其中，图1显示vkorc1-1639g>a位点的2种基因型，灰色部分为待测位点。如图1-a中，待测区域出现的两个峰高c为模板序列碱基，单个峰高t(t＝100％)表示该位点为tt纯合子。由于该位点测序引物设计为反向测序，实际基因型为纯合子aa。如图1-b所示，待测区域出现两个半峰高c(其中两个峰高为模板序列碱基)，半个峰高t(c＝50％,t＝50％)，即该位点为杂合子ag。其中，图2显示cyp2c9430c>t和cyp2c91075a>c基因型焦磷酸测序与sanger测序对比结果，其中图2-a显示cyp2c9430c>t位点基因型，图2-b和图2-c显示cyp2c91075a>c位点基因型。如图2-a所示，待测区域出现两个峰高g(其中一个为模板序列，g＝95％)，该位点也是反向测序，即基因型为纯合子cc。如图2-b所示，待测区域出现一个峰高a(a＝97％)，即该位点为纯合子aa；如图2-c所示，待测区域出现半个峰高a和半个峰高c(a＝47％，c＝53％)，即该位点为杂合子ac。左边为焦磷酸测序法检测结果，右边为sanger测序法检测结果。所有样本3个位点的两种基因分型方法的结果完全一致。4、基因型分布结果50例标本中，vkorc-1639g>a纯合子aa41例，杂合子ag9例,各占82％和18％，未检出gg纯合子。cyp2c9430c>t只检出纯合子cc，未检出等位基因cyp2c9*2。根据cyp2c91075a>c分型结果，纯合子*1/*1和杂合子*1/*3分别有45例和5例，各占90％和10％，未检出纯合子*3/*3。具体如表4所示：表450例受检者vkorc1和cyp2c9等位基因和基因型频率的分布注：n，等位基因数；n，基因型例数5、结论由以上数据可看出样本的检测结果与sanger测序法检测结果完全一致，可以满足临床上对vkorc1和cyp2c9基因进行准确分型的要求。尽管已参照其具体实施方案描述和阐明了本发明，但本领域技术人员会认识到，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对其作出各种改变、修改和取代。因此，本发明意在仅受下列权利要求的范围限制且这些权利要求应在合理的程度上尽可能广义地解释。序列表<110>贵州省人民医院<120>一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及方法<130>无<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>根据实验要求而设计，作为vkorc1-1639g>a基因的扩增上游引物<400>1tgttggccaggcttgtcttaaact24<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>根据实验要求而设计，作为vkorc1-1639g>a基因的扩增下游引物<313>(1)..(24)<400>2tgggaagtcaagcaagagaagacc24<210>3<211>15<212>dna<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>根据实验要求而设计，作为vkorc1-1639g>a基因的测序引物<313>(1)..(15)<400>3gcgtgagccaccgca15<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>根据实验要求而设计，作为cyp2c9430c>t基因的扩增上游引物<400>4ctcatgacgctgcggaatttt21<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)..(23)<223>根据实验要求而设计，作为cyp2c9430c>t基因的扩增下游引物<400>5ccacccttggtttttctcaactc23<210>6<211>16<212>dna<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)..(16)<223>根据实验要求而设计，作为cyp2c9430c>t基因的测序引物<400>6gggcttcctcttgaac16<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)..(23)<223>根据实验要求而设计，作为cyp2c91075a>c基因的扩增上游引物<400>7ccaggaagagattgaacgtgtga23<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>根据实验要求而设计，作为cyp2c91075a>c基因的扩增下游引物<400>8tttggggacttcgaaaacatg21<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>根据实验要求而设计，作为cyp2c91075a>c基因的测序引物<400>9cacgaggtccagagatac18当前第1页12