本发明属于分子标记领域，具体涉及一种华北驼绒藜特异性微卫星分子标记及其应用。
背景技术：
华北驼绒藜(ceratoidesarborescens)隶属藜科驼绒藜属，为中国特有植物，其营养丰富、适口性良好，又兼具有抗旱、抗寒、耐贫瘠等特性，是干旱、半干旱地区优良饲草，也是水土保持、防风固沙、国土整治的重要牧草。因此，华北驼绒藜在改良草地、防止草原“三化”及荒漠草原的提质增效应用中具有重要的意义。对华北驼绒藜的基础科学研究是对其进行资源管理、种群重建和资源利用等有重要指导意义，但目前对其研究的方向多集中于生理生化等方面，尚缺乏对其进行遗传多样性和种群遗传结构等种质资源遗传背景调查，种质资源遗传背景调查结果又进一步指导保护方案的制定和辅助育种等。而了解华北驼绒藜的种质资源遗传背景，首要工作是针对其开发高效的特异性的分子标记。
微卫星(microsatellite)也称为ssr(simplesequencerepeats)，是由1～6个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛分布于真核生物基因组中。由于其有数量多、特异的pcr扩增、稳定性好、在基因组内分布均匀、多态性信息丰富、易于检测等特性等诸多优点成为近年来应用广泛的分子标记之一。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种华北驼绒藜特异性微卫星位点，包括t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39核苷酸序列的一种或几种，所述核苷酸序列如seqidno1～seqidno22所示序列。
本发明还提供了用于鉴定上述华北驼绒藜微卫星位点的特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列分别为：
t1引物对序列如seqidno.23和seqidno.24所示；
t6引物对序列如seqidno.25和seqidno.26所示；
t11引物对序列如seqidno.27和seqidno.28所示；
t13引物对序列如seqidno.29和seqidno.30所示；
t15引物对序列如seqidno.31和seqidno.32所示；
t16引物对序列如seqidno.33和seqidno.34所示；
t17引物对序列如seqidno.35和seqidno.36所示；
t20引物对序列如seqidno.37和seqidno.38所示；
t22引物对序列如seqidno.39和seqidno.40所示；
t23引物对序列如seqidno.41和seqidno.42所示；
t25引物对序列如seqidno.43和seqidno.44所示；
t26引物对序列如seqidno.45和seqidno.46所示；
t28引物对序列如seqidno.47和seqidno.48所示；
t29引物对序列如seqidno.49和seqidno.50所示；
t30引物对序列如seqidno.51和seqidno.52所示；
t31引物对序列如seqidno.53和seqidno.54所示；
t34引物对序列如seqidno.55和seqidno.56所示；
t35引物对序列如seqidno.57和seqidno.58所示；
t36引物对序列如seqidno.59和seqidno.60所示；
t37引物对序列如seqidno.61和seqidno.62所示；
t38引物对序列如seqidno.63和seqidno.64所示；
t39引物对序列如seqidno.65和seqidno.66所示。
本发明的另一目的在于提供用于鉴定华北驼绒藜微卫星位点的试剂盒，包括dna聚合酶、dntps、反应缓冲液、引物对与dna模板，其中所述引物对为以下引物对的一种或几种：
t1引物对序列如seqidno.23和seqidno.24所示；
t6引物对序列如seqidno.25和seqidno.26所示；
t11引物对序列如seqidno.27和seqidno.28所示；
t13引物对序列如seqidno.29和seqidno.30所示；
t15引物对序列如seqidno.31和seqidno.32所示；
t16引物对序列如seqidno.33和seqidno.34所示；
t17引物对序列如seqidno.35和seqidno.36所示；
t20引物对序列如seqidno.37和seqidno.38所示；
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t28引物对序列如seqidno.47和seqidno.48所示；
t29引物对序列如seqidno.49和seqidno.50所示；
t30引物对序列如seqidno.51和seqidno.52所示；
t31引物对序列如seqidno.53和seqidno.54所示；
t34引物对序列如seqidno.55和seqidno.56所示；
t35引物对序列如seqidno.57和seqidno.58所示；
t36引物对序列如seqidno.59和seqidno.60所示；
t37引物对序列如seqidno.61和seqidno.62所示；
t38引物对序列如seqidno.63和seqidno.64所示；
t39引物对序列如seqidno.65和seqidno.66所示。
优选地，本发明用于鉴定华北驼绒藜微卫星位点的试剂盒，包括2×easytaqpcrsupermix、引物对、dna模板以及超纯水；更优选地，本发明用于鉴定华北驼绒藜微卫星位点的试剂盒中，包括50-100ngdna模板,7.5ul2×easytaqpcrsupermix(transgenbiotech)，10μm引物对各0.5ul，使用超纯水补齐至15ul；更优选地，所述试剂盒的pcr条件为95℃预变性5min；95℃变性30sec，适宜退火温度下退火30sec，72℃延伸30sec，反应32个循环；72℃延伸10min；其中，所述适宜的退火温度为50℃～61℃；最优选地，所述适宜的退火温度为50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃。
优选的，所述华北驼绒藜的鉴定包括以下步骤：以前述试剂盒对待测样品的基因组dna进行pcr扩增，将扩增产物与微卫星序列进行对比：若含有上述技术方案所述的至少一种微卫星分子标记，则判定所述待测样品为华北驼绒藜；若不含有上述技术方案所述的任意一种微卫星分子标记，则判定所述待测样品不是华北驼绒藜。
本发明的再一方面为提供上述华北驼绒藜的微卫星位点及其特异性引物对的筛选方法，包括以下步骤：
1)收集华北驼绒藜样品并提取dna；
2)对步骤1)获得的dna，构建rna-seqcdna文库，并对所述rna-seqcdna文库进行高通量测序；
3)检测微卫星位点并设计微卫星位点的引物对；
4)筛选并检测微卫星位点及其特异性引物对。
优选地，在本发明的华北驼绒藜的微卫星位点及其特异性引物对的筛选方法中，所述步骤1)中提取dna步骤为ctab法；
优选地，在本发明的华北驼绒藜的微卫星位点及其特异性引物对的筛选方法中，所述步骤2)中rna-seqcdna文库的高通量测序使用luminahiseq3000测序平台进行高通量测序；
优选地，在本发明的华北驼绒藜的微卫星位点及其特异性引物对的筛选方法中，所述步骤3)中采用batchprimer3在线分析工具对所述步骤2)组装完成的序列检测微卫星位点序列并在微卫星位点的侧翼序列上进行引物设计；更优选地，所述微卫星位点检测的条件为重复单元为2个碱基时，重复次数需大于等于6；重复单元为3个碱基时，重复次数需大于等于5；重复单元为4、5和6个碱基时，重复次数需大于等于4；更优选地，所述微卫星位点的特异性引物设计的原则为扩增目的片段为100～200bp，引物gc含量为40～60％，上下游引物退火温度(tm)在50～60℃之间且差异小于5℃。
优选地，在本发明的华北驼绒藜的微卫星位点及其特异性引物对的筛选方法中，所述步骤4)中筛选所述微卫星特异性引物的方法为：使用华北驼绒藜dna对步骤3)获得的特异性引物对进行pcr扩增并检测，筛选能够稳定扩增出目标条带并具有多态性的引物对；
优选地，在本发明的华北驼绒藜的微卫星位点及其特异性引物对的筛选方法中，所述步骤4)中检测所述微卫星特异性引物方法为：使用tamara350荧光分子量标准在abi3730dna测序仪中使用聚丙烯酰胺凝胶对筛选出来的引物对进行基因分型；基因分型的结果使用genmarker软件进行读取，并输入excel文件；使用excelmircosatellitetoolkit程序统计各微卫星位点的期望杂合度(expectedheterozygosity,he)、观测杂合度(observedheterozygosity，ho)和多态性信息含量(polymorphicinformationcontent,pic)，以检测所述微卫星位点的多态性状况，筛选出上述三个多态性数值均大于0.5作为微卫星位点的特异引物对。
因此，本发明提供了华北驼绒藜的微卫星位点及其特异性引物在藜科驼绒藜属植株的基因标记、定位与qtl分析、品种鉴定、种群及进化研究、分子标记辅助育种中的应用。
本发明与现有技术相比，本发明首次公开了华北驼绒藜的22条特异性微卫星序列及22对特异性微卫星引物。这些位点在对华北驼绒藜的遗传多样性分析、保护遗传学研究、种质资源调查和辅助育种中起到重要作用，也为研究植物抗旱机制的研究提供基础材料。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、dna抽提
样品采集后使用硅胶保存，共使用到32份华北驼绒藜样品，采集自内蒙古阿拉善左旗。样品采用ctab法进行dna抽提。
2、建库、高通量测序及组装
使用illuminatruseqstrandedtotalrnasampleprepkit(晶能生物技术(上海)有限公司)构建华北驼绒藜的标准rna-seqcdna文库；采用illuminahiseq3000测序平台的双端测序模式对构建的rna-seqcdna文库进行高通量测序。对经过质量控制分析后的高质量序列进行样本组装。序列经组装后共得到92629个原始序列(unigene)。
3、微卫星序列检测和引物设计
采用batchprimer3在线分析工具对所述步骤2组装完成的序列检测微卫星位点序列并在微卫星位点的侧翼序列上进行引物设计；所述微卫星位点检测的条件为重复单元为2个碱基时，重复次数需大于等于6；重复单元为3个碱基时，重复次数需大于等于5；重复单元为4、5和6个碱基时，重复次数需大于等于4；所述微卫星位点的引物设计的原则为扩增目的片段为100～200bp，引物gc含量为40～60％，上下游引物退火温度(tm)在50～60℃之间且差异小于5℃。
在此条件下，共检测到7534个微卫星序列，设计到5978对引物对。
4、微卫星引物的初步筛选
在5978对设计成功的引物对中选择50个引物对进行pcr扩增条件确定。选择的原则是：优选重复碱基单元为2或者3(这类微卫星多态性较高)；优选重复序列无碱基变异、无插入或者缺失的；优选重复单元数目大的(但不超过50个)。
使用8个华北驼绒藜样品的dna为模板，对这50个引物对进行梯度pcr扩增。梯度pcr反应体系如下：50-100ngdna模板,7.5ul2×easytaqpcrsupermix(transgenbiotech)，10μm上下游引物各0.5ul，使用超纯水补齐至15ul。梯度pcr反应循环设置如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，45～65℃范围内12个梯度温度下退火30sec，72℃延伸15sec，反应32个循环；最后72℃延伸10min。本发明所述12个梯度优选为50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃。
梯度pcr得到的扩增产物使用2％的琼脂糖-eb凝胶电泳检测，选取符合以下条件的引物对作为初步筛选引物对：(1)扩增产物为单一条带；(2)片段大小符合目的片段大小；(3)在8个个体中均扩增得到一致结果。记录符合上述条件时的pcr退火温度，记为该引物对的最适退火温度。
在此条件下，共得到25个初筛引物对。
4、微卫星位点的多态性检测
对上述初筛引物对的上游引物5’端加上荧光标记(fam/hex/tamra)，并使用32个华北驼绒藜样品的dna进行扩增。pcr反应体系为：50-100ngdna模板，7.5ul2×easytaqpcrsupermix(transgenbiotech)，10μm上下游引物各0.5ul，使用超纯水补齐至15ul。循环设置为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，最适退火温度下退火30sec，72℃延伸15sec，反应35个循环；72℃延伸10min。
扩增产物使用tamara350荧光分子量标准在abi3730dna测序仪中使用聚丙烯酰胺凝胶进行基因分型。基因分析的结果使用genmarke软件进行读取，并输入excel文件。使用excelmircosatellitetoolkit程序计算期望杂合度(expectedheterozygosity，he)、观测杂合度(observedheterozygosity，ho)和多态性信息含量(polymorphicinformationcontent,pic)，以检测所述微卫星位点的多态性状况，选择上述三个多态性数值均大于0.5的位点。
最终获得22个稳定的高多态性微卫星位点，所述微卫星位点命名为t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39；所述t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39的核苷酸序列分别如seqidno1～seqidno22所示序列；所述t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39；所述t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39引物对依次为：
t1引物对序列如seqidno.23和seqidno.24所示；
t6引物对序列如seqidno.25和seqidno.26所示；
t11引物对序列如seqidno.27和seqidno.28所示；
t13引物对序列如seqidno.29和seqidno.30所示；
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t36引物对序列如seqidno.59和seqidno.60所示；
t37引物对序列如seqidno.61和seqidno.62所示；
t38引物对序列如seqidno.63和seqidno.64所示；
t39引物对序列如seqidno.65和seqidno.66所示。
所述t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39；所述t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39微卫星位点的遗传多样性数据见表1。
表1：微卫星位点遗传多样性检测结果
由表1数据可以看出，本发明提供的用于鉴定的微卫星位点的分子标记多态性数据均大于0.5，均可以用于遗传多样性调查、种群遗传结构分析、个体识别以及亲缘关系鉴定等遗传学分析。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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<110>内蒙古自治区农牧业科学院
<120>一种华北驼绒藜特异性微卫星分子标记及其应用
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