一种TMA熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于微生物学领域，具体涉及一种tma熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的试剂盒及方法。

背景技术：

细菌感染是临床常见的感染性疾病，其发病率和死亡率高，如果得不到早期的诊断和治疗，会严重危及患者的生命。从临床样本中直接分离得到细菌表示感染严重需要立即进行抗菌治疗。不同的致病菌对药物种类和浓度的敏感性不同，治疗成功的关键在于早期应用合适足量的药物。而传统的检测致病菌的方法如显微镜检查、培养法、生物化学检查和免疫学方法等，由于各种因素的影响，通常需要几种方法联合使用，而且耗时也较长，需要1～3d，这期间用药不当往往使得患者病情加重或增加菌株耐药性。特别是在多种细菌联合感染的情况下，更增加了菌种鉴定和用药的复杂性。因此，建立一种快速且特异性强的微生物检测方法是十分必要的。

转录介导的核酸扩增技术(transcriptionmediatedamplification，tma)是近年来发展起来的一种直接快速检测rna的等温扩增技术，它克服了以往核酸扩增的不足，更为简便高效，尤其适用于rna病毒的检测。高分辨率熔解曲线分析技术(highresolutionmelting，简称hrm)，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和snp检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。hrm技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。不同核酸分子的片段长短、gc含量、gc分布等是不同的，因此任何双链dna分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。hrm技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是新一代dna序列分析技术，被广泛用于基因型分析领域。该技术无须进行电泳，dna片段也无须特殊的荧光标记，操作极为简便。本试剂盒借用tma技术和焦磷酸测序技术，开发了一种tma-焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的试剂盒及方法，可以检测二十余种临床常见致病细菌。本试剂盒主要用于辅助临床医生诊断和治疗，其检测临床意义主要为：在进行细菌感染治疗时，合理正确地使用抗生素非常重要，而每种菌都有相应适用的抗生素，如果不能快速准确地鉴定细菌种类，就可能会导致手术治疗失败、并发症增多、感染复发、住院时间延长、昂贵抗生素及其它药物的使用增加等。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种tma熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的试剂盒，以克服现有技术的不足，从而细菌感染患者科学用药提供依据和指导作用。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

tma熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的引物和探针，包括如下序列：

(1)tma反应引物：其核苷酸序列如seqidno.1～4所示；

(2)分子信标探针：其核苷酸序列如seqidno.5～7所示；

(3)测序引物：其核苷酸序列如seqidno.8所示。

具体tma反应引物包括正向引物f1、f2和反向引物r1、r2；

所述正向引物f1和反向引物r1的碱基序列表示如下：

正向引物f1：5’-gaagagtttgatcatggctcag-3’；

反向引物r1：5’-aattctaatacgactcactatagggagaaggttactcacccgtccgccact-3’；

所述正向引物f2和反向引物r2的碱基序列表示如下：

正向引物f2：5’-gcaacgcgaagaaccttacc-3’；

反向引物r2：5’-aattctaatacgactcactatagggagaaggacgacagccatgcagcacct-3’；

所述正向引物f1、f2的5’端标记生物素；

所述反向引物r1、r2的5’端的31个碱基是增加的t7噬菌体启动子序列，而3’端20个碱基是与细菌16srrna互补的特异性序列；

所述分子信标探针的碱基序列表示如下：

分子信标探针p1：5’-gcgcggcctaatacatgcaagtcgagcgaacggacggggagcttgcccgcgc-3’；

分子信标探针p2：5’-gcccgttagagatagaggcttcaccttcggaggacaatgtgaacgggc-3’；

分子信标探针p3：5’-cgcgcgggccgaacacaaaaagttaagcttcttagcgccgattgtagccgcgcg-3’；

所述分子信标探针p1在其寡核苷酸dna分子的5’端标记荧光报告基团cy5，3’端标记荧光淬灭基团dabcyl；p1的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的40个碱基是与细菌16srrna反义链互补的特异性序列；

所述分子信标探针p2在其寡核苷酸dna分子的5’端标记荧光报告基团hex，3’端标记荧光淬灭基团dabcyl；p2的5’端和3’端的7个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的34个碱基是与细菌16srrna反义链互补的特异性序列；

所述分子信标探针p3在其寡核苷酸dna分子的5’端标记荧光报告基团fam，3’端标记荧光淬灭基团dabcyl；p3的5’端和3’端的7个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的40个碱基是与细菌16srrna反义链互补的特异性序列；

tma熔解曲线法联合焦磷酸测序法检测临床常见致病细菌试剂盒，该试剂盒包括rna提取试剂、2×tma反应液、5×酶混合液、单链纯化试剂、测序试剂。

其中，所述rna提取试剂包括：裂解液、洗涤液i、洗涤液ⅱ、洗脱液te；

所述裂解液包括如下组分：2～8m胍盐、50～200mmtris、0.5％～10％体积百分数的表面活性剂，所述胍盐为异硫氰酸胍或盐酸胍，所述的表面活性剂为tween20、np40或者tritonx-100；

所述洗涤液i包括如下组分：2～6m胍盐、50～200mmtris、0.5％～10％体积百分数的表面活性剂，所述胍盐为异硫氰酸胍或盐酸胍，所述的表面活性剂为tween20、np40或者tritonx-100；

所述洗涤液ⅱ包括如下组分：10～100mmtris、20～100mmedta、65～80％体积百分数的乙醇；

所述洗脱液te包括如下组分：10mmtris、1mmedta，ph8.0。

其中，所述2×tma反应液包括：0.4～1μmseqidno.1～4所示的寡核苷酸、0.05～0.5μm3种分子信标探针、80mmtris-hcl(ph8.0)、24mmmgcl2、140mmkcl、2mmdntps、4mmntps和30％(v/v)二甲基亚砜。

其中，所述5×酶混合液包括：200um-mlv、1000ut7rnapol和105μgbsa；

所述单链纯化试剂包含：75％(v/v)乙醇溶液，0.2mnaoh，10mmph7.6三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐溶液，结合缓冲液，退火缓冲液，链亲和素包被的磁珠；

所述测序试剂包含：dna聚合酶、atp硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物aps、荧光素和dntp。

上述tma熔解曲线法联合焦磷酸测序法检测临床常见致病细菌试剂盒在检测致病细菌中的应用。

使用上述tma熔解曲线法联合焦磷酸测序法检测临床常见致病细菌试剂盒检测临床常见致病细菌的方法，包括步骤：

(1)待测样品或细菌rna的提取；

(2)tma扩增：取步骤(1)提取好的rna溶液5ul，加入10ul2×tma反应液中，混匀，65℃，5min，41℃，2min；然后加入5ul5×酶混合液，混匀，置于41℃恒温扩增30min(可直接放置roche荧光定量pcr仪上)；

(3)熔解曲线检测：在荧光定量pcr仪上设置：95℃，2min；按照0.14℃/step升温速率，从35℃到75℃逐渐升高温度，熔解曲线分析程序记录每一次升温分子信标产生的荧光值，meltinganalysis程序在荧光定量pcr仪(lightcycler480型，roche公司)上进行；

(4)结果分析：根据步骤(3)中检测样本的熔解曲线峰值(tm)来判断结果。首先是质控系统判断，即阴性对照和空白对照均无熔解峰，否则系统检测无效。当系统检测有效时，判断待测样本结果，不同菌对应不同熔解tm值；

(5)焦磷酸测序：当按照步骤(4)无法判定出细菌种属时，将步骤(3)产物取出与链亲和素包被的磁珠结合进行单链纯化；然后将单链纯化产物进行焦磷酸测序；将测序结果与ncbi数据进行比对确定所测样本菌属。

有益效果：

本发明的试剂盒根据目前已有的细菌16srrna基因序列的保守区设计引物和探针，保证检测方法的特异性。本发明采用改进的转录介导的核酸扩增技术(tma)-熔解曲线技术-焦磷酸测序技术，特异性强，具有与pcr检测方法相似的灵敏度，低污染(扩增产物rna在自然环境下易于降解)、快速(tma-熔解曲线检测只需要1小时左右，单链纯化+焦磷酸测序也仅需1小时即可完成)，能在1小时左右完成临床常见致病细菌80％菌属的鉴定，而2小时内可完成所有临床感染细菌种属的鉴定。将在临床微生物的快速鉴定和检测分析中发挥重要作用，应用前景广阔。

附图说明

图1：异变形杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱克雷伯菌检测结果图，其中1为奇异变形杆菌、2为阴沟肠杆菌、3为洋葱克雷伯菌、4为阴性对照、5为空白对照。

图2：越南伯克霍尔德氏菌焦磷酸测序结果。

图3：纽氏放线菌焦磷酸测序结果。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：一种tma熔解曲线法联合焦磷酸测序法检测临床常见致病细菌的方法

1.提取临床标本rna(利用试剂盒中的rna提取试剂)

仪器：天隆np968核酸提取仪

步骤：

a.取5个临床标本，离心收集沉淀，加入300μl生理盐水，混匀后转移至96深孔板裂解孔中，加入300μl试剂盒中的裂解液，150μl异丙醇(自备)和20μl试剂盒中的磁珠；

b.核酸提取仪上提取rna，大约15～30min。

2.tma熔解曲线检测

仪器：roche罗氏480ii实时荧光定量pcr

a.以步骤1所得rna为模板，利用细菌16srrna保守区的特异性引物(seqidno.1～4)和分子信标探针(seqidno.5～7)进行tma-熔解曲线检测；

其中，所述的tma扩增体系为：2×tma反应液10μl(包含引物f1、f2、r1、r2和分子信标探针p1、p2、p3)，5×酶混合液4μl，提取好的rna6μl；反应条件为：65℃5min；41℃，30min；然后95℃，2min；35～75℃，升温速率为0.14℃/step，收集每一次升温分子信标探针产生的荧光值。

b.根据步骤a所得熔解曲线tm位置的不同，完成常规细菌的鉴定，如图1所示。

3.焦磷酸测序

仪器：qiagenpyromarkq96id测序仪

3.1单链纯化：

对于一些不常见的或者步骤2不能完全区分的样本，利用试剂盒中的单链纯化试剂对步骤2的tma扩增产物进行单链纯化,具体操作步骤如下：

1)在使用前，确保所有溶液都达到室温；打开烘箱电源开关，使温度达到80℃；

2)在psq96板中加入45μlannealingbuffer(退火缓冲液)和1-2μl10um的测序引物(seqidno：8)；

3)在振荡器上充分混匀sepharosebeads(链亲和素标记的磁珠)；

4)将所需sepharosebeads量(按每样本3μl计算)转移到一个1.5mleppendorf管中；

5)在sepharosebeads中加入bindingbuffer(结合缓冲液)，使得平均每个样品约有50μl的体积，在振荡器上将混合物充分混匀；

6)将以上混合物加入tma扩增产物(约50μl反应体积)中，每样本加50μl；

7)常温下、在振荡器上将pcr板混匀10分钟，使得sepharosebeads与生物素标记产物充分结合；

8)在vacuumprepworkstation中，四个液体槽中依次加入180ml纯水、120ml70％乙醇、washingbuffer和denaturationbuffer；

9)打开vacuumprepworkstation的泵，将vacuumpreptool在纯水中清洗30秒；

10)将vacuumpreptool移到pcr板孔中，抓取结合了生物素标记核酸的sepharosebeads；

11)拿起pcr板，检查beads是否都被吸附在了vacuumpreptool上；

12)将vacuumpreptool放入70％乙醇中15秒，然后移到denatureationbuffer中15秒，再移到washingbuffer中清洗30秒；

13)把tool悬放在含有测序引物的psq板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，将vacuumpreptool放入含有测序引物的psq板中，旋转摇动，以释放sepharosebeads；

14)将放有纯化样本的psq96板放在thermoplate上，置于80℃烘箱中加热2分钟，取出后冷却到室温，然后放入测序仪，进行下游pyrosequencing反应。

3.2纯化完毕后清洗：

1)不开真空泵和阀门，使用少量纯水清洗vacuumpreptool，使少量未脱落的beads洗脱下来；

2)更换纯水后再打开真空泵和阀门，用约300ml纯水清洗tool；

3)关掉真空泵和阀门，将vacuumpreptool侧放，室温晾干；

4)清洗所有盛装试剂溶液的塑料槽，自然晾干；

5)用湿布擦拭纯化设备表面。

3.3焦磷酸测序

1)调出设定好的运行程序文件，点击“view”的下拉键，选择“run”，按照软件自动计算本次实验的各试剂使用量，添加各试剂成分至试剂加样仓；

2)把准备好的样本和试剂舱放入仪器相应的位置，点击屏幕右下端的“run”开始焦磷酸测序；

3)检测完成后，首先点击软件进程状态窗口的“close”键以保存测序结果；

3.4焦磷酸测序结果分析

1)在“sqaruns”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“sqamode”，点击“analyzeall”键，对所有检测标本进行分析；

2)读取每个检测样本的碱基序列，在网上genebank中进行比对分析，确定所检测样本菌属类型，如图2、图3所示。

综上，本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测临床常见致病细菌及疑难细菌，能够满足临床检验实际工作的要求，利于临床细菌感染患者准备合理地进行抗菌药物治疗提供指导，进而避免抗生素的滥用，为患者节省宝贵的治疗时间，提高患者生活质量。

sequencelisting

<110>杭州迪安医学检验中心有限公司

<120>一种tma熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用

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