本发明属于烟草制品生物学效应评价技术领域，特别涉及一种用于检测口含烟制品对细胞活性氧分泌影响的方法。
背景技术：
随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。口含烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。根据产品的组分及形态特点，口含烟制品分为传统含烟叶原料的snus型口含烟制品和不含烟叶原料的新型口含烟制品(如烟草含片)。口含烟研发人员在产品配方设计初期将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整形成最终的产品配方。然而初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试指标对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，无统一的标准方法。
机体在遭受各种不利刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ros)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。这种现象被称为氧化性损伤，氧化性损伤是一种广谱性损伤机制，活性氧是氧化性损伤的一种重要效应生物标志物，对其进行测定，可用于产品初选配方的进一步筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于检测口含烟制品对细胞活性氧分泌影响的方法，为电子烟制品的安全性评估提供参考。
一种用于检测口含烟制品对细胞活性氧分泌影响的方法，包括以下步骤：
(1)受试物的前处理；
(2)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的制备；
(3)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；
(4)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞接种；
(5)受试物的分组；
(6)受试物检测剂量的设定；
(7)受试物培养品的制备；
(8)受试物的孵育；
(9)加入阳性对照物；
(10)装载探针；
(11)样品测定；
(12)活性氧水平计算。
本发明优选的实施方案中，上述的方法，包括以下具体步骤：
(1)受试物的前处理：准确称取1.0g口含烟制品，加入30ml无血清培养基，于37℃下静置24h，萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；
(2)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的制备：人口腔角质细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％co2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用人口腔角质细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人口腔角质细胞单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人口腔角质细胞单细胞悬浮液加入人口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/ml，再按接种量为200μl/孔，接种到96孔细胞培养板中，将96孔细胞培养板置于37℃、5vt％co2培养箱内培养24h；
(5)受试物的分组：将受试物分为四组：空白组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；各组的构成为：空白组只加okm细胞培养基；细胞对照组为okm细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞；阳性对照组为在okm细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞并添加阳性对照物；检测样品组为在okm细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞并添加受试物；每个检测计量设4孔平行；
(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为5个非零剂量：将步骤(1)获得的样品萃取液用okm口腔角质细胞培养基稀释成不同浓度的待测样品，剂量浓度分别为12.5％、25％、50％、75％、100％，样品萃取液与人口腔角质细胞的体积比分别为12.5％、25％、50％、75％和100％；
(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中96孔细胞培养板内的okm细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：空白组只加okm细胞培养基；细胞对照组为okm细胞培养基；阳性对照组为okm细胞培养基+阳性对照物；检测样品组为okm细胞培养基+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；并且4组培养品用okm细胞培养基将每孔中的液体体积补足到200μl/孔；
(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的96孔细胞培养板置于37℃、5vt％co2培养箱中孵育24h；
(9)加入阳性对照物：取4孔正常细胞，去除培养基，加入100μl浓度为50mg/ml的阳性对照物物，将96孔细胞培养板置于37℃、5vt％co2培养箱中孵育1h；
(10)装载探针：除去步骤(8)和(9)细胞培养板中的细胞培养基，每孔加入终浓度为10μmol/l的2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针100μl，37℃、5vt％co2培养箱中孵育1h；
(11)样品测定：除去步骤(10)细胞培养板中的液体，用pbs磷酸缓冲盐溶液缓冲液洗3次，去除未进入细胞内的2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针，用荧光酶标仪于488nm激发波长下测定光度值；
(12)活性氧水平计算：根据(11)获得的光度值，按照下列公式计算活性氧水平，以相对荧光强度表征：
x＝(ftest-fblank)/(fcontrol-fblank)
式中：
x——相对荧光强度；
ftest——步骤(11)所得检测样品组多孔平均的光度值；
fblank——步骤(11)所得空白组多孔平均的光度值；
fcontrol——步骤(11)所得细胞对照组多孔平均的光度值。
本发明优选的实施方案中，步骤(10)所述的细胞裂解液购买于碧云天公司，是一种在非变性条件下裂解细胞的裂解液。
本发明优选的实施方案中，步骤(5)中所述的okm细胞为oralkeratinocytemedium细胞，属于商品化产品，可购买于市场。
本发明优选的实施方案中，阳性对照物为能够刺激细胞活性氧(ros)分泌量增多的物质，本发明中的阳性对照物为rosup阳性对照物，购买于市场。
本发明有益效果：
本发明对口含烟制品对细胞活性氧分泌影响进行了综合研究，确定了口含烟制品的检测剂量，以及口含烟制品前处理方法，制定了一种适用于检测口含烟制品对细胞活性氧分泌影响的方法。本发明对样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测口含烟制品对细胞活性氧水平影响的方法。
具体实施方式
下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。
本实施例针对2种国外市售口含烟萃取液对人口腔角质细胞活性氧水平的影响测试。
本实施例包括如下步骤：
(1)受试物的前处理：准确称取1.0g口含烟制品，加入30ml无血清培养基，于37℃下静置24h，萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；
(2)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的制备：人口腔角质细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％co2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约2min，用人口腔角质细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人口腔角质细胞单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人口腔角质细胞单细胞悬浮液加入人口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/ml，再按接种量为200μl/孔，接种到96孔细胞培养板中，将96孔细胞培养板置于37℃、5vt％co2培养箱内培养24h；
(5)受试物的分组：将受试物分为四组：空白组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；各组的构成为：空白组只加okm细胞培养基；细胞对照组为okm细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞；阳性对照组为在okm细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞并添加阳性对照物；检测样品组为在okm细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞并添加受试物；每个检测计量设4孔平行；
(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为5个非零剂量：将步骤(1)获得的样品萃取液用okm口腔角质细胞培养基稀释成不同浓度的待测样品，剂量浓度分别为12.5％、25％、50％、75％、100％，样品萃取液与人口腔角质细胞的体积比分别为12.5％、25％、50％、75％和100％；
(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中96孔细胞培养板内的okm细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：空白组只加okm细胞培养基；细胞对照组为okm细胞培养基；阳性对照组为okm细胞培养基+阳性对照物；检测样品组为okm细胞培养基+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；并且4组培养品用okm细胞培养基将每孔中的液体体积补足到200μl/孔；
(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的96孔细胞培养板置于37℃、5vt％co2培养箱中孵育24h；
(9)加入阳性对照物：取4孔正常细胞，去除培养基，加入100μl浓度为50mg/ml的阳性对照物物，将96孔细胞培养板置于37℃、5vt％co2培养箱中孵育1h；
(10)装载探针：除去步骤(8)和(9)细胞培养板中的细胞培养基，每孔加入终浓度为10μmol/l的2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针100μl，37℃、5vt％co2培养箱中孵育1h；
(11)样品测定：除去步骤(10)细胞培养板中的液体，用pbs磷酸缓冲盐溶液缓冲液洗3次，去除未进入细胞内的2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针，用荧光酶标仪于488nm激发波长下测定光度值；
(12)活性氧水平计算：根据(11)获得的光度值，按照下列公式计算活性氧水平，以相对荧光强度表征：
x＝(ftest-fblank)/(fcontrol-fblank)
式中：
x——相对荧光强度；
ftest——步骤(11)所得检测样品组多孔平均的光度值；
fblank——步骤(11)所得空白组多孔平均的光度值；
fcontrol——步骤(11)所得细胞对照组多孔平均的光度值。
表12种口含烟萃取液对人口腔角质细胞hok活性氧水平的影响
由试验结果可以看出，在本发明方法给出的样品处理方法、检测剂量条件下，样品1#、2#在检测剂量范围内对hok细胞活性氧水平存在影响，且有剂量效应关系，与0剂量组相比存在显著差异(p<0.05)；样品1#在检测剂量范围内与2#样品相比存在显著差异(p<0.05)；以上结果显示，该方法能够有效检测不同的口含烟制品对hok细胞活性氧水平影响的差异。