一种酶法转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的方法与流程

本发明属于酶工程及生物医药领域，具体涉及重组酶体系在催化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元中的方法。

背景技术：

淫羊藿苷元(icaritin)为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿中的一种多羟基黄酮类单体成分，它在淫羊藿体内含量极低,为淫羊藿苷的水解产物,具有雌激素样作用、调节免疫、促进心肌细胞再生和分化、促骨质保护、壮阳、抗肝损伤及延缓肝纤维化、抗肿瘤等多种药理活性。随着国内外对淫羊藿苷元的新药效的发现,未来淫羊藿苷元的国际市场需求很大。因此如何开发高效环保地制备淫羊藿苷元的方法是目前研究的重点。

由于淫羊藿苷是淫羊藿的含量最较高的黄酮苷类化合物之一，它与淫羊藿苷元具有相同的母核，因此，目前淫羊藿苷元的制备主要针对淫羊藿苷，采用酶法或酸法将其母核3号及7号碳位上的糖基去除从而获得淫羊藿苷元。如cn103305564通过酶解、酸解相结合，将淫羊藿苷转化为淫羊藿素，但由于酸解反应过程可控性差，副产物多，产品收率低，关键是强酸性条件容易改变黄酮母核的结构特别是4’号位的甲氧基，使其工艺具有局限性；cn101302548通过一种商品化的β-葡萄糖苷酶将淫羊藿苷转化为淫羊藿苷元，虽然该酶能获得淫羊藿苷元，但是其水解时间长(24小时)，最高酶解收率也仅为55％左右，根据酶解效果及酶专一性特性，可知使用的β-葡萄糖苷酶来源于传统微生物发酵，其酶不是纯的β-葡萄糖苷酶；cn104561178采用柚苷酶将淫羊藿苷转化生成淫羊藿苷元。柚苷酶是由微生物发酵制备获得的具有α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的复合酶，专一特性主要为特异性水解柚皮苷。该方法中α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶比例不可控、作用的先后顺序不可控，且反应时间长(30小时)，效率低(该专利仅说明能够生成淫羊藿苷元)。

综合现有研究结果可以发现：(1)目前的研究工艺只能以淫羊藿苷为底物制备淫羊藿苷元，还无法将淫羊藿总黄酮的主要组份(淫羊藿苷、朝霍定a、朝霍定b及朝霍定c)同时转化为淫羊藿苷元；(2)目前制备淫羊藿苷元的得率及效率还有待提高。(3)已有技术中，在制备过程中，首先要获得淫羊藿提取物，然后分离得到淫羊藿苷，然后通过酶法或微生物法转化，不仅大大增加了成本，而且没有充分高效利用朝霍定a、朝霍定b、朝霍定c。另一方面，使得大量获取淫羊藿苷资源问题非常突出，无法保障规模化制备淫羊藿苷元。而本发明提供了一种酶法转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的方法，仅仅通过二种糖苷酶，就能高效地将淫羊藿总黄酮几乎完全转化制备得到淫羊藿苷元。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明提供了一种酶法转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的方法，从微生物来源的糖苷水解酶基因库中成功筛选获得了一种能有效降解淫羊藿苷母核结构上鼠李糖残基的α-l-鼠李糖苷酶及一种高效降解其母核结构中葡萄糖残基和木糖残基的耐高温双功能β-葡萄糖苷酶，仅仅通过二种糖苷酶，就能高效地将淫羊藿总黄酮中多种淫羊藿苷几乎完全转化制备得到淫羊藿苷元。有效降低了制备成本和提高了资源高效利用率。

技术方案：一种酶法转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的方法，由耐热α-l-鼠李糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶组成的双酶体系均能转化淫羊藿总黄酮中的多组分黄酮糖苷生成淫羊藿苷元，所述多组分黄酮糖苷为淫羊藿苷、朝霍定a、朝霍定b和朝霍定c。

上述耐热α-l-鼠李糖苷酶来源于thermotogapetrophiladsm13995的α-l-鼠李糖苷酶基因的大肠杆菌重组菌。

上述耐热β-葡萄糖苷酶来源于dictyoglomusthermophilumdsm3960gh3β-葡萄糖苷酶基因的大肠杆菌重组菌。

酶法转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的方法，配制ph4.5，50mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入淫羊藿总黄酮至浓度为5g/l，同时加入thermotogapetrophiladsm13995的耐热α-l-鼠李糖苷酶至30u/ml，以及dictyoglomusthermophilumdsm3960gh3家族的耐热β-葡萄糖苷酶至25u/ml，在85℃反应1h。

由耐热α-l-鼠李糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶组成的双酶体系在转化淫羊藿总黄酮中的多组分黄酮糖苷为淫羊藿苷元中的应用。

转化淫羊藿总黄酮中的多组分黄酮糖苷为淫羊藿苷元的酶组合物，由耐热α-l-鼠李糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶组成。

上述方法制得的淫羊藿苷元。

上述的富含淫羊藿苷元产品在制备治疗乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌药物中的应用。

该方法所使用的α-l-鼠李糖苷酶有来源于aspergillusterreusccf3059、aspergillusnigernl-1、bacteroidesthetaiotaomicronvpi-5482、thermotogapetrophiladsm13995，所使用的β-葡萄糖苷酶有来源于thermotogathermarumdsm5069gh1家族、thermotogathermarumdsm5069gh3家族、thermotogapetrophiladsm13995gh1家族、thermotogapetrophiladsm13995gh3家族、dictyoglomusthermophilumdsm3960gh3家族。

最佳的双酶降解淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元工艺的获取过程为：比较了1)同时加来源于thermotogapetrophiladsm13995的α-l-鼠李糖苷酶和来源于dictyoglomusthermophilumdsm3960gh3家族β-葡萄糖苷/β-木糖苷双功能酶；2)先加来源于dictyoglomusthermophilumdsm3960家族的β-葡萄糖苷/β-木糖苷双功能酶后加来源于thermotogapetrophiladsm13995的α-l-鼠李糖苷酶；3)先加来源于来源于thermotogapetrophiladsm13995的α-l-鼠李糖苷酶后加来源于dictyoglomusthermophilumdsm3960家族的β-葡萄糖苷/β-木糖苷双功能酶的3种不同加酶方式转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的摩尔转化率，确定了先加α-l-鼠李糖苷酶后加β-葡萄糖苷/β-木糖苷双功能酶的方式其转化率最高。

有益效果：1.本发明转化底物的范围广，将转化的目标由淫羊藿苷扩大到淫羊藿总黄酮中的淫羊藿苷、朝霍定a、朝霍定b、朝霍定c等。提高了淫羊藿苷元的产率，也提高了淫羊藿的利用率。2.本发明利用成分明确的两种重组酶催化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元，酶法转化的摩尔转化率大于97％。3.本发明筛选了不同来源的α-l-鼠李糖苷酶并提供了一种获得能够高效降解淫羊藿黄酮苷鼠李糖残基的来源于thermotogapetrophiladsm13995的α-l-鼠李糖苷酶，该酶的最适反应温度为90℃，温度稳定性较好。4.本发明筛选了不同来源的β-葡萄糖苷酶获得能高效降解淫羊藿苷葡萄糖残基和木糖残基的双功能gh3家族的β-葡萄糖苷酶，该酶最适反应温度为85℃，催化效率高。5.本发明提供了一种高效、环保地制备淫羊藿苷元的方法，制备的淫羊藿苷元具有更强的生物活性。可将淫羊藿总黄酮中多组分黄酮类化合物几乎完全转化为目的产物；最适作用温度高，使得底物及中间产物都具有良好溶解性，不需要助溶剂；酶解时间短，得率高。6.淫羊藿总黄酮经双酶转化后得到以淫羊藿苷元为主要黄酮成分的产品，在抑制人肝癌细胞hepg2、肺癌细胞a549和小鼠结肠癌细胞ct26增殖方面的活性，显著强于未经转化的淫羊藿总黄酮。

附图说明

图1为酶法转化淫羊藿总黄酮中多组分黄酮糖苷制备淫羊藿苷元的示意图，其中淫羊藿总黄酮的多组分包括朝霍定a、朝霍定b、朝霍定c及淫羊藿苷等。它们的具体结构特征见图1右侧表格。

图2为淫羊藿总黄酮中的主要组分的标准品的hplc谱图，其中1.朝霍定a；2.朝霍定b；3.朝霍定c；4.淫羊藿苷及其稀有组分5(宝霍苷ⅰ)和目标产物6(淫羊藿苷元)，显示目前的hplc方法可有效地对这几种组分进行分析，且方法高效稳定。

图3为多种不同来源α-l-鼠李糖苷酶和多种不同来源β-葡萄糖苷分别对淫羊藿黄酮糖苷的转化效率图。其中a为4中不同来源α-l-鼠李糖苷酶转化淫羊藿苷生成淫羊藿次苷ⅰ的转化效率图，其转化效率以淫羊藿次苷ⅰ的含量计；b为5种不同来源不同家族β-葡萄糖苷分别转化朝霍定a、朝霍定b和淫羊藿苷生产宝霍苷ⅰ的转化效率图，其转化率以宝霍苷ⅰ的含量计。注：a中tperha表示来源于thermotogapetrophiladsm13995的α-l-鼠李糖苷酶、atrha表示来源于aspergillusterreusccf3059的α-l-鼠李糖苷酶、anrha表示来源于aspergillusnigernl-1的α-l-鼠李糖苷酶、btrha表示来源于bacteroidesthetaiotaomicronvpi-5482的α-l-鼠李糖苷酶；b中ttbgl1表示来源于thermotogathermarumdsm5069gh1家族；tpbgl1表示来源于thermotogapetrophiladsm13995gh1家族的β-葡萄糖苷酶；ttbgl3表示来源于thermotogathermarumdsm5069gh3家族；tpbgl3表示来源于thermotogapetrophiladsm13995gh3家族的β-葡萄糖苷酶；dthbgl3表示dictyoglomusthermophilumdsm3960的β-葡萄糖苷酶。

图4为三种转化方法的转化率比较图，其中转化率以淫羊藿苷元的含量计。其中方法1为先加葡萄糖苷/木糖苷双功能酶后加鼠李糖苷酶，方法2为同时添加葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶，方法3为先加鼠李糖苷酶后加葡萄糖苷/木糖苷双功能酶。

图5为α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶协同降解淫羊藿苷转化前后的hplc图。其中a为淫羊藿总黄酮对照，b为方法1先加葡萄糖苷/木糖苷双功能酶后加鼠李糖苷酶反应后液相谱图，c为方法2同时添加葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶后反应产物液相谱图，d为方法3先加鼠李糖苷酶后加葡萄糖苷/木糖苷双功能酶反应后产物液相谱图。(图中各峰对应的化合物名称：1，朝藿定a；2，朝藿定b；3，朝藿定c；4，淫羊藿苷；5，淫羊藿苷元)

图6为淫羊藿总黄酮中各黄酮单体的抗肿瘤活性比较图。其中hepg2为人肝癌细胞，a549为人肺癌细胞，ct26为小鼠结肠癌细胞，4t1为小鼠乳腺癌细胞。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。

实施例1：本发明所述α-鼠李糖苷酶基因的获得及重组质粒pet-tperha的构建

1.1thermotogapetrophiladsm13995的培养

thermotogapetrophiladsm13995购于dsmz菌种保藏中心(www.dsmz.de)编号为13995，其培养基配方为：10g/l淀粉、5g/l胰蛋白胨、3g/l酵母提取物、5g/l肉浸液、10g/l2-马啉乙磺酸、10mg/l七水合硫酸铁、1mg/l刃天青,调整ph为7.2。用注射器按照0.5％接种量接种，85℃静止培养24h，收集细胞。

1.2基因组dna的提取

(1)静置培养thermotogapetrophiladsm13995约24小时，取30ml菌液4,000g离心10min收集细胞。

(2)用9.5mlte缓冲液重悬菌体，加入0.5ml10％十二烷基硫酸钠(sds)和50μl蛋白酶k(20mg/ml)，混合均匀，37℃保温1h。

(3)加入1.8ml5mol/lnacl，1.5ml十六烷基三乙基溴化铵(ctab)/nacl，混匀，65℃温育20min。

(4)加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000g离心10min。

(5)为防止剪切力造成基因组dna断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6,000g离心10min。

(6)另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状dna沉淀清晰可见。

(7)用吸管将dna缠绕其上，在70％酒精中清洗。

(8)用无菌牙签将dna从吸管上刮下，转入1.5ml离心管中。

(9)室温下风干，加500μlte缓冲液溶解。

(10)取50μl用核酸蛋白检测仪检测dna浓度。

1.3重组质粒pet-bgl的构建

按照已知的thermotogapetrophiladsm13995耐高糖α-鼠李糖苷酶基因(登录号：wp_011944094.1)设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。以提取的thermotogapetrophiladsm13995的基因组dna为模板，用合成的引物进行pcr扩增，扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加pyrobest聚合酶，加40μl石蜡油密封；28次循环(94℃，30s；58℃，30s；72℃，2.9min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对pcr扩增产物进行纯化。得到α-鼠李糖苷酶tperha的dna分子。

将得到的α-鼠李糖苷酶tperha的dna分子和pet-20b分别用ndei和noti进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌jm109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有新型α-鼠李糖苷酶dna分子的重组质粒pet-tperha。

实施例2：本发明所述耐热α-鼠李糖苷酶的制备

将重组质粒pet-tperha转化大肠杆菌jm109(de3)宿主菌(购自novagen公司)，在含有卡那霉素(50μg/ml)的lb平板(lb培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl5g/l，琼脂15g/l)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200ml的lb培养基中(50μg/ml卡那霉素)37℃，200rpm振荡培养至od600为0.6时，加入终浓度为0.5mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，30℃培养6h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体。

由于重组质粒pet-tperha中含有his-tag标签，通过his·bindpurificationkit(购自novagen公司)进行纯化，得到纯化的重组酶。具体操作过程：

a.样品的处理

(1)将洗涤过的菌体，用1×bindingbuffer8ml重悬，超声波破壁。

(2)破壁后，13,000g离心30min，取上清即为样品。

b.处理柱子

(1)取1ml填料装柱。

(2)用3ml的无菌水洗柱子。

(3)用5ml的1×chargebuffer洗柱子。

(4)用3ml的1×bindingbuffer洗柱子。

c.上样

(1)将样品加入柱子，控制流速约每分钟6滴。

(2)用3ml1×bindingbuffer洗柱子，除去未结合的蛋白质。

(3)用4ml含有20mm咪唑的洗脱液洗柱子，除去杂蛋白。

(4)用80mmol/l咪唑的洗脱液洗柱子，将目的蛋白洗脱下来。

(5)用4ml1×stripbuffer洗柱子。

通过此过程得到纯化的α-鼠李糖苷酶。

实施例3：本发明所述β-葡萄糖苷/β-木糖苷双功能酶基因的获得及重组质粒pet-dthbgl3的构建

3.1dictyoglomusthermophilumdsm3960的培养

dictyoglomusthermophilumdsm3960购于dsmz菌种保藏中心(www.dsmz.de)编号为3960，其培养基配方为：磷酸二氢钾1.5g/l，十二水合磷酸氢二钠4.2g/l，氯化铵0.5g/l，六水合氯化镁0.38g/l，二水和氯化钙0.06g/l，六水合硫酸铁铵0.04g/l，六水氯化钴2.9mg/l，二水合钼酸钠2.4mg/l，五水合硒酸钠1.7mg/l，四水和氯化锰2mg/l，硫酸锌2.8mg/l，可溶性淀粉5g/l、蛋白胨2g/l、酵母提取物2g/l、碳酸钠1g/l、盐酸半胱氨酸1g/l、刃天青钠1g/l，在氮气环境下脱氧，调整ph为7.2。用注射器按照0.5％接种量接种，85℃静止培养24h，收集细胞。

3.2基因组dna的提取

(1)静置培养dictyoglomusthermophilumdsm3960约24小时，取30ml菌液4,000g离心10min收集细胞。

(2)用9.5mlte缓冲液重悬菌体，加入0.5ml10％十二烷基硫酸钠(sds)和50μl蛋白酶k(20mg/ml)，混合均匀，37℃保温1h。

(3)加入1.8ml5mol/lnacl，1.5ml十六烷基三乙基溴化铵(ctab)/nacl，混匀，65℃温育20min。

(4)加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000g离心10min。

(5)为防止剪切力造成基因组dna断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6,000g离心10min。

(6)另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状dna沉淀清晰可见。

(7)用吸管将dna缠绕其上，在70％酒精中清洗。

(8)用无菌牙签将dna从吸管上刮下，转入1.5ml离心管中。

(9)室温下风干，加500μlte缓冲液溶解。

(10)取50μl用核酸蛋白检测仪检测dna浓度。

3.3重组质粒pet-dthbgl3的构建

按照已知的dictyoglomusthermophilumdsm3960新型β-葡萄糖苷酶基因(登录号：wp_041723615.1)设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。以提取的dictyoglomusthermophilumdsm3960的基因组dna为模板，用合成的引物进行pcr扩增，扩增的条件是94℃，3min；30次循环(94℃，10s；58℃，30s；72℃，2.7min)；72℃，5min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对pcr扩增产物进行纯化。得到β-葡萄糖苷酶dthbgl3的dna分子。

将得到的β-葡萄糖苷酶dthbgl3的dna分子和pet-28a分别用ncoi和xhoi进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌jm109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有新型β-葡萄糖苷酶dna分子的重组质粒pet-dthbgl3。

实施例4：本发明所述β-葡萄糖苷酶的制备

将重组质粒pet-dthbgl3转化大肠杆菌jm109(de3)宿主菌(购自novagen公司)，在含有卡那霉素(50μg/ml)的lb平板(lb培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl5g/l，琼脂15g/l)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200ml的lb培养基中(50μg/ml卡那霉素)37℃，200rpm振荡培养至od600为0.6时，加入终浓度为0.005-0.01mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，30℃培养6h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体。

由于重组质粒pet-dthbgl3中含有his-tag标签，通过his·bindpurificationkit(购自novagen公司)进行纯化，得到纯化的重组酶。具体操作过程：

a.样品的处理

(1)将洗涤过的菌体，用1×bindingbuffer8ml重悬，超声波破壁。

(2)破壁后，13,000g离心30min，取上清即为样品。

b.处理柱子

(1)取1ml填料装柱。

(2)用3ml的无菌水洗柱子。

(3)用5ml的1×chargebuffer洗柱子。

(4)用3ml的1×bindingbuffer洗柱子。

c.上样

(1)将样品加入柱子，控制流速约每分钟6滴。

(2)用3ml1×bindingbuffer洗柱子，除去未结合的蛋白质。

(3)用8ml含有20mm咪唑的洗脱液洗柱子，除去杂蛋白。

(4)用200mmol/l咪唑的洗脱液洗柱子，将目的蛋白洗脱下来。

(5)用4ml1×stripbuffer洗柱子。

通过此过程得到纯化的β-葡萄糖苷酶，通过sds-page电泳后染色鉴定β-葡萄糖苷酶的纯度，结果如图2所示。

β-葡萄糖苷酶基因在宿主菌jm109(de3)中表达量较高，目的蛋白通过histag标签纯化后，其洗脱液中β-葡萄糖苷酶dth3纯度较高，在80kda处有单一的条带，达到电泳纯级别。

实施例5：α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶酶活测定

以对硝基苯酚-α-鼠李糖苷(pnp-r)为底物，水解得到的对硝基苯酚与碳酸钠发生显色反应，在405nm的波长下测定产物的吸光度。100μl反应体系包括75μl100mm最适ph的缓冲液，20μl5mm底物，混匀预热后加入5μl稀释酶液，最适温度下反应10min，然后加入0.3ml1mnaco3终止反应，混匀后在405nm条件下酶标仪测定。同时做有酶液无底物的对照和有底物无酶液的对照。

以对硝基苯酚-β-葡萄糖苷(pnp-g)为底物，水解得到的对硝基苯酚与碳酸钠发生显色反应，在405nm的波长下测定产物的吸光度。100μl反应体系包括90μl100mm最适ph缓冲液，5μl20mm底物，混匀预热后加入5μl稀释酶液，最适温度下反应10min，然后加入0.3ml1mnaco3终止反应，混匀后在405nm条件下酶标仪测定。同时做有酶液无底物的对照和有底物无酶液的对照。

以对硝基苯酚-β-木糖苷(pnp-x)为底物，水解得到的对硝基苯酚与碳酸钠发生显色反应，在405nm的波长下测定产物的吸光度。100μl反应体系包括90μl100mm最适ph缓冲液，5μl20mm底物，混匀预热后加入5μl稀释酶液，最适温度下反应10min，然后加入0.3ml1mnaco3终止反应，混匀后在405nm条件下酶标仪测定。同时做有酶液无底物的对照和有底物无酶液的对照。

一个酶活单位(u)定义为：在最适合的条件下，水解释放1μmol对硝基酚所需的酶量。

对照标准曲线，计算酶活：

酶活(u/ml)＝c×v1/(t×v2)×n

c：由对硝基苯酚标准方程计算出的酶反应后的对硝基苯酚含量(μmol/ml)；

v1：反应体系总体积(ml)；

t：酶与底物反应时间(min)；

v2：酶反应时酶液的体积(ml)；

n：酶液稀释倍数。

实施例6：不同来源的重组酶水解淫羊藿黄酮多组分催化能力的比较

6.1比较不同来源α-l-鼠李糖苷酶对淫羊藿苷元的催化能力

淫羊藿苷的浓度为1g/l，以三种不同来源的α-l-鼠李糖苷酶在各自最适温度，最适ph为转化条件，均加入60u/ml的酶，反应1h，通过hplc进行检测。结果如图3a所示：来源于thermotogapetrophiladsm13995和aspergillusterreusccf3059的α-l-鼠李糖苷酶能够有效的转化淫羊藿苷为淫羊藿次苷i，其摩尔转化率分别为45％和12％；而来源于aspergillusnigernl-1和bacteroidesthetaiotaomicronvpi-5482的α-l-鼠李糖苷酶几乎无法转化淫羊藿苷。因此，选取来源thermotogapetrophiladsm13995的α-l-鼠李糖苷酶用于淫羊藿总黄酮提取物的转化。

6.2比较不同来源β-葡萄糖苷对朝霍定a、朝霍定b和淫羊藿苷的催化能力

以五种不同来源的β-葡萄糖苷酶分别水解1g/l朝霍定a、朝霍定b和淫羊藿苷，反应条件为各自最适温度和最适ph，酶添加量均为25u/ml的纯酶，反应时间1h，通过hplc进行检测。结果如图3b所示5种不同来源不同家族的β-葡萄糖苷酶均能高效地将朝定霍a和淫羊藿苷转化为目标产物宝霍苷i，然而仅有来源于dictyoglomusthermophilumdsm3960的β-葡萄糖苷酶dthbgl3具有β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶酶活力，因此仅有dthbgl3能够将朝霍定b高效地转化为目标产物宝霍苷i，其转化率达到99.2％。据此，选用来源于dictyoglomusthermophilumdsm3960的β-葡萄糖苷/β-木糖苷双功能酶dthbgl3转化淫羊藿总黄酮提取物。

实施例7：酶法催化转化淫羊藿苷制备淫羊藿苷元的工艺研究

将选取的来源于thermotogapetrophiladsm13995的α-l-鼠李糖苷酶和来源于dictyoglomusthermophilumdsm3960的β-葡萄糖苷/β-木糖苷双功能酶dthbgl3分别以不同方法转化淫羊藿提取物。其中淫羊藿总黄酮提取物由江苏康源药业股份有限公司提供，其主要成分的含量如下，朝藿定a:1.44％、朝藿定b:2.76％、朝藿定c:5.96％、淫羊藿苷:9.05％、宝霍苷i:0.95％。

7.1方法1-先加β-葡萄糖苷/β-木糖苷双功能酶后加α-l-鼠李糖苷酶

淫羊藿提取物的浓度为1g/l，ph4.5100mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，先加入30u/mldictyoglomusthermophilumdsm3960gh3家族的β-葡萄糖苷/β-木糖苷双功能酶，然后再在90℃继续反应1h，加入75u/mlthermotogapetrophiladsm13995的α-l-鼠李糖苷酶在90℃下反应1h通过hplc进行检测。结果如图4所示：淫羊藿苷元的摩尔转化率为：87.3％。

7.2方法2-同时加α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷/β-木糖苷双功能酶

淫羊藿提取物的浓度为1g/l，ph4.5100mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入75u/mlthermotogapetrophiladsm13995的α-l-鼠李糖苷酶和30u/mldictyoglomusthermophilumdsm3960gh3家族的β-葡萄糖苷酶，在90℃下反应2h，通过hplc进行检测。结果如图4所示：淫羊藿苷元的摩尔转化率为：90.9％。

7.3方法3-先加α-l-鼠李糖苷酶再加β-葡萄糖苷/β-木糖苷双功能酶

淫羊藿提取物的浓度为1g/l，ph4.5100mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，先加入75u/mlthermotogapetrophiladsm13995的α-l-鼠李糖苷酶在90℃下反应1h，然后再加入30u/mldictyoglomusthermophilumdsm3960gh3家族的β-葡萄糖苷酶在90℃继续反应1h，通过hplc进行检测。结果如图4所示：淫羊藿苷元的摩尔转化率为：95.1％。

因此，确定转化淫羊藿提取物制备淫羊藿苷元的最佳工艺为方法3-先加来源于thermotogapetrophiladsm13995的α-l-鼠李糖苷酶再加来源于dictyoglomusthermophilumdsm3960的β-葡萄糖苷/β-木糖苷双功能酶dthbgl3。

实施例8：本发明所述的淫羊藿总黄酮经dthbgl3和tperha转化后抗肿瘤活性

在96孔板中每孔接种3000个细胞，放入37℃培养，待细胞贴壁6h后，每孔加入不同浓度的淫羊藿黄酮培养72h，于实验终点前4h向每孔加入20μlmtt(4mg/ml)，实验终点时取出96孔板，于1000rcf离心，然后吸去上清，加入200μldmso，570nm处测吸光值。根据以下公式计算待测样品对肿瘤细胞体外增殖的抑制率：

抑制率＝[100－(od570(实验孔)－od570(空白对照))/(od(不加药对照空)－od570(空白对照)×100)％

根据实施例7中淫羊藿总黄酮经dthbgl3和tperha转化前后的hplc图谱可见，淫羊藿总黄酮本来主要由朝藿定a、b、c和淫羊藿苷组成，其中，淫羊藿苷的含量最高，转化产物主要为淫羊藿苷元。如图6所示的体外抗肿瘤活性研究表明，在100μm的浓度下，淫羊藿苷元对人肝癌hepg2、肺癌a549、小鼠结肠癌ct26、乳腺癌4t1的增殖抑制率分别高达88％、46％、61％和89％，显著高于淫羊藿总黄酮中的其他单体成分。因此，淫羊藿总黄酮经dthbgl3和tperha转化为淫羊藿苷元后，抗肿瘤活性得到了提高。