本发明涉及一种利用喜树悬浮细胞生产n1-乙酰犬尿胺的方法，属于医药生物
技术领域：
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背景技术：
：随着植物细胞法的建立和运用，目前有很多研究通过该方法获得目的产物以及高附加值的植物次生代谢产物。植物细胞培养法是在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行震荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。该方法具有以下优势：1)不受地理、季节和气候条件的限制；2)节省土地，降低成本，生产周期短，可大大提高经济效益；3)可代替整体植株在工厂内连续生产所需产物；4)可通过添加抑制剂等使生物合成按照人的意志进行；5)可通过诱变筛选，获得高产细胞株，并且可以进行特定的生物转化获得新的有用物质。目前，已有文献报道推测了一些多环芳烃生物碱化合物的生物合成途径，其中色氨酸代谢产生犬尿胺及其类似物就是这类化合物生物合成的关键步骤。其中犬尿胺经乙酰化得到n1-乙酰犬尿胺就有可能参与到一些多环芳烃生物碱化合物的生物合成。因为多环芳烃生物碱类化合物普遍具有非常好的药理活性，所以很多研究者通过模拟生物合成的方法来指导这类化合物的有机合成，目前也有一些化合物成功全合成出来。从合成路线来看，犬尿胺的合成都是必不可少并且是非常关键的。但是，犬尿胺的合成相对比较繁琐，产率也只有60％左右。技术实现要素：针对现有制备n1-乙酰犬尿胺的工艺方法复杂、制备途径单一的问题，本发明提供了一种通过喜树悬浮细胞将色胺转化为n1-乙酰犬尿胺的生产方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：(1)将喜树悬浮细胞接种到ms30液体培养基进行培养，培养过程中添加色胺；(2)收集相应的悬浮细胞和细胞培养液，(3)分离提取n1-乙酰犬尿胺。上述步骤(1)中的ms30液体培养基含有0.2～1mg/l萘乙酸、0.2～1mg/l6-苄基氨基嘌呤、0.05～0.3mg/l2，4-二氯苯氧乙酸和20-50mmnh4+/no3-，所述nh4+与no3-的摩尔比为5:1；培养条件：光照，摇床100～150rpm，温度25±3℃，ph5-6.5。进一步地，上述步骤(1)中的ms30液体培养基含有0.5mg/l萘乙酸、0.5mg/l6-苄基氨基嘌呤、0.1mg/l2,4-二氯苯氧乙酸和40mmnh4+/no3-，所述nh4+与no3-的摩尔比为5:1；培养条件优选：光照25μmolm-2s-l，摇床125rpm，温度25±0.5℃，ph5-6.5。进一步地，上述步骤(1)中，在喜树悬浮细胞培养3天后加色胺，继续培养9～15天。所述收集相应的悬浮细胞和细胞培养液，分离提取n1-乙酰犬尿胺步骤可按常规方法操作：在步骤(1)所述继续培养9～15天后，通过过滤的方法收集悬浮细胞和细胞培养液，混合物经抽滤漏斗过滤至无液体滴出，分别收集滤液与滤纸上的细胞；所述滤液为细胞培养液，其中含有n1-乙酰犬尿胺，将滤液经乙酸乙酯萃取，有机相于40℃减压浓缩干燥得到培养液提取物；所述滤纸上的细胞经60℃干燥研磨破碎，甲醇浸泡过夜，40℃减压浓缩得到细胞提取物，提取物用纯水溶解，乙酸乙酯萃取，有机相于40℃减压浓缩干燥得到细胞提取物；培养液提取物和细胞提取物加入乙酸乙酯溶解，经针头过滤器过滤得到n1-乙酰犬尿胺粗提物，样品经硅胶柱层析，成功分离制备得到n1-乙酰犬尿胺。本发明的有益效果：(1)通过在喜树悬浮细胞中添加色胺，成功分离得到n1-乙酰犬尿胺。该化合物及前体物质犬尿胺在有机合成中有很好的运用，并且其部分衍生物都具有很好的药理活性。(2)与现有技术相比，本发明所述对象为喜树悬浮细胞，具有生长繁殖迅速，易培养、发酵等优点；利用喜树悬浮细胞获得n1-乙酰犬尿胺的方法简单易控制。具体实施方式以下对本发明的实施方式进行详细说明。实施例一：喜树无菌苗建立1.试验材料1.1植物材料选取正常健康生长的喜树果实，按照常规操作去皮、清洗、消毒。本实施例中采用先去除果实种皮，再依次用5％triton浸泡3min，无菌水反复冲洗，浓度为75％乙醇浸泡1min，1％次氯酸钠溶液浸泡3min，无菌水冲洗10次，每次1min，最后用无菌滤纸吸除喜树种子表面水分，待用。1.2培养基1/2ms固体培养基：1/2ms培养基添加0.35％琼脂(sigmachemical,mo)，ph5.8，121℃高压灭菌30min。2.种子接种到培养基将准备好的种子按常规无菌操作方法接种培养。将准备好的种子接种到本例1.2节中的培养基上，25℃避光培养1周，再光照培养。光照培养条件：白光(40μmolm-2s-l)，光周期为16h，温度25℃，待幼苗长出。实施例二：喜树愈伤组织建立1试验材料1.1植物材料实施例一中得到的无菌幼苗。按照常规无菌操作，用无菌手术刀将叶片切成10mm×10mm小块，待用。1.2培养基7种以ms30(ms培养基添加30mg/l的蔗糖)为基础培养基，以及不同组成和浓度的生长调节因子的固体培养基。如表1：表1培养基a-j组成成分2.无菌叶片接种到培养基将准备好的叶片按常规无菌操作方法接种培养。将准备好的叶片接种到表1中相应的培养基上，温度25℃避光培养5～6周，待愈伤组织长出。不同培养基进行3组平行实验。3.制备喜树愈伤组织代谢产物每组实验分别取2g新鲜的愈伤组织，60℃烘干研磨破碎，甲醇浸泡过夜，过滤收集滤液，40℃减压浓缩得到愈伤组织提取物。提取物用纯水溶解，乙酸乙酯萃取，有机相于40℃减压浓缩至干燥得到发酵液提取物，细胞提取物加3ml乙酸乙酯溶解，经针头滤器过滤得到代谢产物粗提物。4.喜树愈伤组织代谢产物的hplc-dad检测采用hplc-dad分别检测喜树愈伤组织的代谢产物。hplc-dad分析检测条件：altimacolumnc18柱(5μm,250mm×4.6mm)，流动相a：甲醇，流动相b：水+0.1％甲酸，柱温：35℃，流速：1ml/min；进样量：20μl；检测器：二极管阵列(dad)；检测波长：254nm、266nm、373nm；梯度洗脱程序如表2所示。表2hplc-dad梯度洗脱条件时间(min)流动相a％流动相b％05951250503080203998245982在上述条件下，喜树碱标准品的保留时间为：25.39min；10-羟基喜树碱标准品的保留时间为：23.14min；喜树愈伤组织提取物中喜树碱的保留时间为：25.38min；10-羟基喜树碱的保留时间为：23.15min。hplc-dad结果显示，b、c培养基中的喜树愈伤组织有喜树碱产生，b培养基培养出的愈伤组织中喜树碱含量较高些，从而筛选出喜树愈伤组织培养的最佳培养基，结果如表3。表3不同培养基诱导愈伤组织生成5.喜树愈伤组织继代培养将上一步的愈伤组织按常规无菌操作方法接种培养。将上一步得到的愈伤组织用无菌刀小心切割接种到b固体培养基，光照培养。光照培养条件：白光(40μmolm-2s-l)，光周期为16h，温度25℃，湿度70％。每20～25天继代一次。实施例三：喜树悬浮细胞系建立1.试验材料1.1植物材料实施例二中得到的喜树愈伤组织，按照常规无菌操作，用无菌手术刀切成小块，待用。1.2培养基ms30液体培养基添加0.5mg/lnaa，2mg/lbap。2.喜树愈伤组织接种到培养基将准备好的愈伤组织按常规无菌操作方法接种培养。将愈伤组织接种到100ml液体培养基中，持续光照培养。光照培养条件：白光(25μmolm-2s-l)，温度25℃，湿度70％，转速125rpm。3～5天后，待培养液中有细胞长出，吸取5ml细胞悬浮液转入100ml新的液体培养基，相同条件下培养，得到喜树悬浮细胞，待用。以后每10天继代一次。实施例四：喜树悬浮细胞培养基筛选1.试验材料1.1植物材料实施例三中得到的喜树悬浮细胞。1.2培养基10种不同组分的液体培养基，如表4：表4ms30培养基(a-g)和b5、ls、ds液体培养基添加相应的植物生长调节因子其中：6-bap为6-苄基氨基嘌呤；sorbitol为山梨糖醇；artemisinicacid为青蒿酸；thiamine为硫胺；inositol为肌醇；kinetin为激动素。2.喜树悬浮细胞接种到培养基将准备好的喜树悬浮细胞按常规无菌操作方法接种培养。将喜树悬浮细胞2ml接种到100ml表4中相应液体培养基a-j中，持续光照培养。光照培养条件：白光(25μmolm-2s-l)，温度25℃，湿度70％，转速125rpm。3.喜树悬浮细胞重量测定和代谢产物制备每天收集2瓶喜树悬浮细胞培养液，采集天数总共为19天。培养液经抽滤漏斗过滤至无液体滴出。分别收集滤液与滤纸上的喜树细胞；将滤纸上的细胞称重，得到细胞鲜重；所述滤液经乙酸乙酯萃取，有机相于40℃减压浓缩至干得到培养液提取物；所述细胞经60℃干燥称重，得到细胞干重；将干燥的细胞研磨破碎，甲醇浸泡过夜，40℃减压浓缩得到细胞提取物，提取物用纯水溶解，乙酸乙酯萃取，有机相于40℃减压浓缩至干得到细胞提取物；培养液提取物或细胞提取物加入乙酸乙酯溶解，经针头过滤器过滤得到代谢产物粗提物。4.喜树悬浮细胞代谢产物的hplc-dad检测检测方法同实施例二，喜树愈伤组织代谢产物的hplc-dad检测方法，最后筛选得到喜树悬浮细胞最优的培养基组成为：ms30培养基添加0.5mg/lnaa，0.5mg/lbap，0.1mg/l2,4-d，40mmnh4+/no3-(nh4+/no3-的摩尔比为5:1)，即d培养基。实施例五：n1-乙酰犬尿胺的小量制备1.试验材料1.1植物材料实施例三得到的喜树悬浮细胞。1.2培养基培养基及培养条件如表1所示。表1喜树悬浮细胞ms30液体培养基及条件2.喜树悬浮细胞培养、色胺添加及n-乙酰犬尿胺的制备将准备好的喜树悬浮细胞按常规无菌操作方法接种培养。将5组2ml喜树悬浮细胞分别接种到100ml如表1所示的培养基中，按表1中的培养条件持续光照摇床培养，湿度70％，培养3天后，每组吸取10ml喜树悬浮细胞母液接种到500ml的相同的表1所示培养基c3中，相同条件下再次培养；再次培养的第3天，每组分别添加浓度为10μm、100μm、500μm、800μm、1000μm的色胺，继续培养的12天后，通过过滤的方法收集悬浮细胞和细胞培养液，混合物经抽滤漏斗过滤至无液体滴出，分别收集滤液与滤纸上的细胞；所述滤液为细胞培养液，将滤液经乙酸乙酯萃取，有机相于40℃减压浓缩干燥得到培养液提取物；所述滤纸上的细胞经60℃干燥研磨破碎，甲醇浸泡过夜，40℃减压浓缩得到细胞提取物，提取物用纯水溶解，乙酸乙酯萃取，有机相于40℃减压浓缩干燥得到细胞提取物；培养液提取物和细胞提取物加入乙酸乙酯溶解，经针头过滤器过滤得到n1-乙酰犬尿胺粗提物，样品经硅胶柱层析，成功分离制备得到n1-乙酰犬尿胺。浓缩干燥得到c1样品0.20g、c2样品1.9g、c3样品0.21g、c4样品0.20g、c5样品0.17g。实施例六：n1-乙酰犬尿胺的大量制备1.试验材料1.1植物材料喜树悬浮细胞。1.2培养基培养基及培养条件如表1所示。2.喜树悬浮细胞接种到培养基将准备好的喜树悬浮细胞按常规无菌操作方法接种培养。方法同实施例五，培养18l喜树悬浮细胞液，添加色胺浓度为500μm，继续培养的9天后过滤收集悬浮细胞和细胞培养液。最后浓缩干燥得到样品3.7g。实施例七：n1-乙酰犬尿胺的分离实施例六中得到的样品经硅胶柱层析(200-300目，石油醚：乙酸乙酯＝20：1；10：1；5：1；2：1；1：1和氯仿：甲醇＝5：1；1：1；1：2；0：1)分成15个组分a-o，液相分析其中组分a～c含有目的峰，即色胺转化产物峰，分析条件同实施例二中喜树愈伤组织代谢产物的hplc-dad检测方法。合并该3组分，经硅胶柱层析(200-300目，石油醚：丙酮＝40:1，30:1，20:1，10:1，5:1)分成5个组分，再进行液相分析，方法同上。第3部位含有n1-乙酰犬尿胺，采用液相制备，制备条件：流动相a(h2o+0.1％甲酸)和b(甲醇+0.1％甲酸)，如表2。流速：3ml/min。检查波长：230nm，373nm。表2hplc-dad梯度洗脱条件时间(min)流动相a％流动相b％0595205545306020359823998240595目的产物保留时间:24.57min，即分离制备得到n1-乙酰犬尿胺：黄色粉末，氢谱数据(400mhz,cd3od):δ7.77(dd,j＝8.2,1.4hz,1h),7.25(ddd,j＝8.5,7.0,1.5hz,1h),6.75(dd,j＝8.4,0.8hz,1h),6.61(ddd,j＝8.2,7.0,1.2hz,1h),3.55(t,j＝6.5hz,2h),3.19(t,j＝6.5hz,2h),1.93(s,3h)；碳谱数据(150mhz,cd3od):δ201.92,173.37,152.70,135.46,132.22,118.55,118.34,116.20,39.28,36.39,22.52；高分辨质谱数据:m/z229.0952[m+na]+(calcdforc11h14n2nao2,229.0947,error-2.1ppm)。当前第1页12