专利名称：肝祖细胞的条件培养基的制作方法
肝袓细胞的条件培养基本发明属于生物药用制品和再生医学的领域。经证实，干细胞制品对人或动物组织发挥再生作用。测试生物人工肝支持物在治 疗暴发性肝功能衰竭(FHF)中的效能的临床试验，已经提供了一些有希望的结果，然而现 有的装置尚未表现出对于常规用途而言足够的效能和可靠性，主要是由于缺乏在功能上稳 定的人肝细胞来源(Kobayashi N, Okitsu T, Tanaka N. Cell choice for bioartificial livers. Keio J Med. 2003; 52 (3) : 151-7)。肝干细胞或甚至源自其它组织的干细胞，可以 潜在地提供人肝细胞的替代来源。除了骨髓以外，干细胞存在于成体组织(诸如肝和中枢神 经系统)中，且具有比以前已知的大很多的可塑性。经证实，在国际专利申请W02006/126236中所述的人肝多能祖/干细胞经历向多 种组织细胞类型的分化，并发挥器官再生作用。这些细胞源自表达肝细胞标记物的非卵圆 的人肝多能祖细胞系。国际专利申请W02006/126236还公开了分离上述能经历向多种细胞类型的分化 的人肝多能祖/干细胞的方法，所述方法包括下述步骤
(i)在细胞培养基中培养成体肝_衍生的人成熟肝细胞，直至成熟肝细胞死亡，并选择 具有上皮样形态的存活细胞群；
(ii)通过在含血清、含葡萄糖、补加hEGF(人上皮生长因子)和bFGF (碱性成纤维细 胞生长因子)并包含哺乳动物细胞生长必需的常见无机盐、氨基酸和维生素的培养基中培 养，扩增具有上皮样形态的存活细胞群，
且特别地，其中在有冷冻保护剂存在下，在含血清的培养基中冷冻成熟肝细胞，然后在 根据步骤(i)培养之前解冻。W02006/126236的人多能祖细胞(在专利说明书中指定为HLSC)及其制备方法通 过引用完整地并入本文。经证实，间质干细胞(MSC)制品对组织发挥再生作用。例如，已知骨髓_衍生的间 质干细胞通过分泌许多营养分子(包括可溶的胞外基质糖蛋白、细胞因子和生长因子)天然 地支持血细胞生成。但是，干细胞制品的主要缺点是，在施用时造成免疫反应。某些干细胞制品甚至具 有造成癌症的可能性。Parekkadan 等人(Parekkadan B, van Poll D, Suganuma K, Carter EA, Berthiaume F, Tilles AW, Yarmush ML. Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure. PLoS ONE. 2007 Sep 26; 2 (9) : e941)首次评估 了不同的MSC-治疗，诸如递送条件培养基(CM)，以测试它们在诱发严重肝损伤的大鼠模 型中的效能。在该文章中，给大鼠腹膜内地施用共2次D-半乳糖胺(Gal-N)注射。在第 二ffF胃(Van Poll D, Parekkadan B, Cho CH, Berthiaume F, Nahmias Y, Tilles AW, Yarmush ML. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology. 2008 Jan 24; 47 (5) : 1634-1643)中，Parekkadan的研究组研究了 MSC-CM的全身输注是否会在急性损伤的肝中产生肝保护应答，具体地通过抑制细胞死亡和刺激修复程序。该研究组使用 D-半乳糖胺诱导的亚致死方案，证实了在MSC-CM治疗后显著的存活益处和肝酶释放的阻止。考虑到干细胞治疗的上述缺点，再生医学领域中现有的非常有效的制品通常含有 细胞的事实，是应当克服的一个技术问题。因而，本发明的目的是，提供这样的制品，其可有效地用作再生医学领域中的药物 组合物，但是其不含有细胞，从而避免含有细胞、尤其是干细胞的现有制品所造成的缺陷。本发明的另一个目的是，提供制备药物组合物的方法，所述药物组合物在再生医 学领域中是有效的，但是其不含有细胞，从而避免含有细胞、尤其是干细胞的现有制品所造 成的缺陷。通过独立权利要求中定义的制品和方法，实现这些和其它目的。从属权利要求涉及本发明的优选实施方案。从属权利要求和独立权利要求的主题 构成说明书的一个完整部分。使用暴发性肝功能衰竭(FHF)的小鼠模型，发明人证实了通过培养肝祖细胞系 (例如在W02006/126236中公开的非卵圆的人肝多能祖细胞系)生成的无细胞的条件培养基 (无细胞的CM)会对肝发挥再生作用。经证实，通过培养肝祖细胞系生成的无细胞的条件培 养基(无细胞的CM)在器官衰竭的治疗(尤其是肝和肾衰竭的治疗)中是有效的。令人惊 奇地，还发现，肝祖细胞系-CM比在相同条件下制备的间质干细胞-CM明显更有效。具体地，在本说明书的实施例1所述的研究中，给6至7周龄的雄性SCID小鼠腹膜 内注射500 PL含有0.125 μδ LPS和18 mg D-半乳糖胺(GalN)的盐水，以诱导FHF。在 施用LPS和GalN后30分钟、1和3小时后，给小鼠腹膜内注射3 ml条件培养基，其源自在 旋转生物反应器中培养的HLSC。条件培养基的初步分析揭示大量细胞因子、趋化因子和生 长因子。丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶的血清水平在损伤诱导后显著增加，且在注射条 件培养基治疗6天后显著降低。另一方面，通过BrdU、PCNA和Timel测定法评价的肝组织 的组织病理学分析揭示了降低的细胞凋亡和坏死指数和组织形态的恢复。这些研究提供了 HLSC-衍生的条件培养基在炎症治疗和器官再生中的潜在治疗 应用的第一份实验证据。因而，本发明的第一个方面是由无细胞的条件培养基组成的制品，所述无细胞的 条件培养基可通过培养肝祖细胞系、优选非卵圆的人肝多能祖细胞系、更优选在国际专利 申请W02006/126236 (其通过引用并入本文)中公开的非卵圆的人肝多能细胞系得到。包含有效量的上面定义的制品的药物组合物也落入本发明范围内。在下面，构成本发明主题的源自肝祖细胞系的无细胞的条件培养基将被称作“无 细胞的HLSC-CM”。术语“HLSC”表示肝多能祖/干细胞系。优选地，术语“HLSC”表示非卵圆的肝 多能细胞系，更优选地表示在W02006/126236中公开的肝多能祖/干细胞系。更优选地， HLSC细胞系具有在W02006/126236的权利要求1_10的任一项中定义的特征，和/或在 W02006/126236的第7页表I中总结的特征。这些特征通过引用并入本文。构成本发明主题的无细胞的HLSC-CM适合原样或以浓缩形式用作药物组合物。浓 缩形式被浓缩了例如至少约5倍、优选至少约10倍、更优选至少约20倍、甚至更优选约25倍。优选地，从在技术人员已知的GMP条件下培养的肝多能祖/干细胞、优选在 W02006/126236中公开的HLSC细胞系，得到本发明的无细胞的HLSC-CM。或者，从在技术人 员也已知的BAL (生物人工肝)系统中培养的肝多能祖/干细胞、优选在W02006/126236 中公开的HLSC细胞系，可以得到它。用于培养肝多能祖/干细胞和收集其无细胞的条件培养基(CM)的GMP条件的一 个实例如下。通过在W02006/126236中公开的方法，分离肝多能祖/干细胞，其中通过在有胎牛 血清(FCS)(优选在约10%的浓度)、hEGF (人上皮生长因子)和bFGF (碱性成纤维细胞 生长因子)存在下培养祖干细胞，进行所述扩增步骤。FCS、bFGF和hEGF优选地是GMP级， 例如由Invitrogen生产的那些。为了在GMP条件下收集条件培养基，从培养物去除FCS，因为这是不适合注射进人 的异源蛋白。为此，洗涤细胞，并在收集培养基(例如，由添加了 GMP级人白蛋白的α-ΜΕΜ 组成)中培养24小时。白蛋白优选地在约0.05 %的浓度。然后通过离心或过滤，收集无细 胞的条件培养基。在上述体内实验中，证实了本发明的无细胞的HLSC-CM向暴发性肝功能衰竭 (FHF)的动物模型(SCID小鼠)的施用，会提供显著胜过用MSC-CM处理过的SCID小鼠的存 活益处。因而，本发明的另一个方面是用作药物的无细胞的条件细胞培养基，其可通 过培养肝祖细胞系、优选非卵圆的人肝多能祖细胞系、甚至更优选在国际专利申请 W02006/126236中公开的非卵圆的人肝多能细胞系得到。根据一个优选的实施方案，所述药物用于治疗器官衰竭和/或损伤、优选肝和/或 肾衰竭和/或损伤。另外，发明人分析了本发明的无细胞的HLSC-CM的组成，以便鉴别更可能为上述 CM的有益效果提供重要贡献的那些蛋白(例如细胞因子、趋化因子、生长因子和/或其它蛋 白)，从而提供由蛋白混合物组成的简化的药物组合物，所述蛋白混合物能至少部分地模仿 通过如上所述培养HLSC生产的CM的器官再生能力。因而，本发明的另一个方面是简化的药物组合物，其包含药学有效量的至少肝细 胞生长因子(HGF)、白介素6 (IL-6)和白介素8 (IL-8)的混合物。在一个优选的实施方案中，所述简化的药物组合物包含药学有效量的至少肝细胞 生长因子(HGF)、白介素6 (IL-6)、白介素8 (IL-8)和血管内皮生长因子(VEGF)的混合 物。在另一个优选的实施方案中，所述简化的药物组合物包含药学有效量的至少肝细 胞生长因子(HGF)、白介素6 (IL-6)、白介素8 (IL-8)和巨噬细胞刺激蛋白(MSP)和任选 的血管内皮生长因子(VEGF)的混合物。在另一个优选的实施方案中，所述简化的药物组合物包含药学有效量的根据上面 定义的实施方案中的任一个的蛋白和至少一种选自下述的其它蛋白的混合物激活素C、 激活的白细胞粘附分子(ALCAM)、趋化因子(C-C基序)受体4 (CCR4)、富含半胱氨酸的 跨膜 BMP 调节剂 1 (chordin-样)(CRIM)、核心蛋白多糖、Ectodysplasin A2 (EDA-A2)、内皮缩血管肽、成纤维细胞生长因子受体-样1 (FGF R5)、磷脂酰肌醇聚糖3、生长-相 关的癌蛋白(GRO)、胰岛素-样生长因子结合蛋白6 (IGFBP-6)、胰岛素-样生长因子 1 (IGF-1)、白介素20受体、α (IL-20 R α )、含有三环域(kringle)的跨膜蛋白2 (Kremen-2)、潜在转化生长因子β结合蛋白1 (潜在TGF-β bpl)、晶状体纤维的主要 内在蛋白(MIP-2)、MSP β-链、骨保护素/ TNFRSF11B (肿瘤坏死因子受体超家族、成员 lib)、可溶的gpl30 (sgpl30)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(骨结合素)(SPARC)。本发明的简化的药物组合物中的优选细胞因子浓度范围如下 -HGF 1-100 ng/ml，优选 5-80 ng/ml，更优选 10-65 ng/ml ；
-IL-6: 10-200 ng/ml，优选 20-100 ng/ml，更优选 30-50 ng/ml ；
-IL-8:≥ 35 ng/ml，优选 50-600 ng/ml，更优选 100-300 ng/ml ；
-VEGF (如果存在的话):10-400 ng/ml，优选 20-250 ng/ml，更优选 35-175 ng/ml ；
和
-MSP (如果存在的话)1-100 pg/ml，优选 5-80 pg/ml，更优选 5-65 pg/ml。但是，本发明的范围还包括简化的药物组合物的任意稀释或浓缩形式。浓缩形式 是浓缩了例如至少约5倍、优选至少约10倍、更优选至少约20倍、甚至更优选约25倍。稀 释形式是稀释了例如至少约5倍、优选至少约10倍、更优选至少约20倍、甚至更优选至少 约25倍。本发明的简化的药物组合物适合用作药物，具体地用于治疗器官衰竭和/或损 伤、优选肝和/或肾衰竭和/或损伤。根据一个优选的实施方案，配制药物组合物，以便施 用下面的细胞因子剂量
-HGF 0. 01-1 mg/kg，优选 0. 03-0. 8 mg/kg，更优选 0. 1-0. 5 mg/kg ； -白介素 6 (IL-6) 0.01-1 mg/kg，优选 0.03-0. 8 mg/kg，更优选 0. 05-0· 5 mg/kg ； -白介素 8 (IL-8) 0.01-1 mg/kg，优选 0.02-0. 8 mg/kg，更优选 0. 03-0· 5 mg/kg ； -VEGF (如果存在的话):0.01-1 mg/kg，优选0.02-0. 8 mg/kg，更优选0. 04-0. 5 mg/
kg ；
-MSP (如果存在的话):0.01-1 mg/kg，优选 0.02-0. 8 mg/kg，更优选 0. 08-0. 5 mg/
kg 。在一个特别优选的实施方案中，这些细胞因子剂量每天施用1次。应当理解，上面定义的简化的药物组合物，纯粹作为能至少部分地模仿可通过如 上所述培养HLSC得到的CM的器官再生能力的简化的药物组合物的非限制性实例予以提供。从纯粹作为作为例证予以提供的下述实施例，将更清楚地看出本发明的其它目的 和优点。还应当理解，基于下文提供的实施例，可以预见到要求保护的药物组合物和方法 的其它实施方案，而不脱离本发明的范围。实施例1 _初步体内试验
如TO2006/126236所述，分离人肝祖细胞(HLSC)。将细胞培养至60%_70%汇合(约2 X IO6 HLSC/75-cm2烧瓶)，彻底洗涤，并在10 mL添加了 0. 05%人血清白蛋白(GMP生产)的无血清的α-MEM培养基中培养。如以前报道的，从骨髓抽吸物分离人间质干细胞(MSC)， 培养，并表征。在MesenPRO RS 培养基中培养MSC，所述MesenPRO RS 培养基是为了支持 MSC生长而专门配制的减少血清(2% FCS)的培养基。条件培养某的制备
通过离心收集培养MSC和HLSC 24小时后的培养基，制备无细胞的条件培养基。使用 2X IO6细胞的细胞群，进行该实验。然后，使用具有3 kDa分子量截止的超滤单元(Amicon Ultra-PL 3，Millipore)，将培养基浓缩约25倍。得到共250 μ 条件培养基。在3 ml α-MEM (不含FCS)中稀释该浓缩的培养基，至终体积3 ml。在诱导肝损伤后30分钟、1和 3小时，腹膜内地施用1 ml条件培养基。FHF体内樽型
为了诱导暴发性肝功能衰竭(FHF)，如前所述(Lehmann V，Freudenberg MA, Galanos C. Lethal toxicity of ipopoIysaccharide and tumor necrosis factor in normal and D-galactosamine-treated mice. J Exp Med. 1987; 165 (3) : 657-63)，开发了月旨多糖 (LPS)对用D-半乳糖胺(2-氨基-2-脱氧-D-半乳糖)处理的动物的致死毒性。简而言 之，一组10只SCID小鼠接受D-半乳糖胺(GalN) (600 mg/kg)和每只动物0. 125 Ug LPS 的腹膜内注射。发明人以前测得，在8小时内在GalN (600 mg/kg)和LPS (每只动物0.125 μ g)处理的小鼠中诱发100%致死率。作为在500 μ 1无热原的NaCl溶液中的混合物， 施用GalN和LPS。记录死亡，直到注射后24小时。在LPS和GalN注射后30分钟、1和3 小时，给小鼠腹膜内地注射3次Iml HLSC和MSC浓缩的条件培养基。如
图1所示，5只注射 HLSC-衍生的CM的小鼠中的4只存活，而用MSC-衍生的CM处理的小鼠都没有存活。HLSC和MSC条件培养基的细胞因子组成
为了研究如上所述通过培养HLSC和MSC得到的条件培养基的组成，通过多重ELISA (Bioclarma)，测量了 31种不同细胞因子的集合。在含有10% FCS的培养基中培养两种细 胞类型。在培养24小时后，收集条件培养基。还测量了单独的培养基的细胞因子组成。结 果提供在下面的表1中。表1. HLSC相对于MSC:细胞因子生产*
权利要求
1.可通过培养人肝多能祖细胞系得到的条件培养基，其特征在于，它不含有细胞。
2.根据权利要求1的条件培养基组合物，其可通过包括下述步骤的方法得到(i)在细胞培养基中培养成体肝-衍生的人成熟肝细胞，直至成熟肝细胞死亡，并选择 具有上皮样形态的存活细胞群；(ii)通过在含血清、含葡萄糖、补加hEGF(人上皮生长因子)和bFGF (碱性成纤维细 胞生长因子)并包含哺乳动物细胞生长必需的常见无机盐、氨基酸和维生素的培养基中培 养，扩增具有上皮样形态的存活细胞群；和(iii)从细胞培养基分离细胞。
3.根据权利要求2的条件培养基，其中在有冷冻保护剂存在下，在含血清的培养基中 冷冻成熟肝细胞，然后在根据步骤(i)培养之前解冻。
4.根据权利要求1-3中任一项的条件培养基，其中所述培养基包含补加GMP级人白蛋 白的α MEM。
5.根据权利要求1-4中任一项的条件培养基，其浓缩了至少5倍、优选至少10倍、更优 选至少20倍、甚至更优选至少25倍。
6.根据权利要求1-5中任一项的条件培养基，其在GMP条件下生产。
7.—种生产条件培养基的方法，其包括下述步骤(i)在细胞培养基中培养成体肝-衍生的人成熟肝细胞，直至成熟肝细胞死亡，并选择 具有上皮样形态的存活细胞群；(ii)通过在含血清、含葡萄糖、补加hEGF(人上皮生长因子)和bFGF (碱性成纤维细 胞生长因子)并包含哺乳动物细胞生长必需的常见无机盐、氨基酸和维生素的培养基中培 养，扩增具有上皮样形态的存活细胞群；和(iii)从细胞培养基分离细胞。
8.根据权利要求7的方法，其中在有冷冻保护剂存在下，在含血清的培养基中冷冻成 熟肝细胞，然后在根据步骤(i)培养之前解冻。
9.根据权利要求7或8的方法，其中所述培养基包含补加GMP级人白蛋白的αMEM。
10.一种药物组合物，其包含药学有效量的根据权利要求1-6中任一项的条件培养基。
11.用作药物的根据权利要求10的药物组合物。
12.根据权利要求10的药物组合物用于制备治疗损伤或器官衰竭的药物的用途。
13.根据权利要求12的用途，其中所述器官是肝或肾。
14.一种药物组合物，其包含药学有效量的至少肝细胞生长因子(HGF)、白介素6 (IL-6)和白介素8 (IL-8)的混合物。
15.根据权利要求14的药物组合物，其中所述混合物另外包含药学活性量的血管内皮 生长因子(VEGF)。
16.根据权利要求14或15的药物组合物，其中所述混合物另外包含药学活性量的巨噬 细胞刺激蛋白(MSP)。
17.根据权利要求14至16中任一项的药物组合物，其中所述混合物另外包含药学活性 量的至少一种选自下述的其它蛋白激活素C、激活的白细胞粘附分子(ALCAM)、趋化因子 (C-C基序)受体4 (CCR4)、富含半胱氨酸的跨膜BMP调节剂1 (chordin-样)(CRIM)、核 心蛋白多糖、Ectodysplasin A2 (EDA-A2)、内皮缩血管肽、成纤维细胞生长因子受体-样1(FGF R5)、磷脂酰肌醇聚糖3、生长-相关的癌蛋白(GRO)、胰岛素-样生长因子结合蛋白 6 (IGFBP-6)、胰岛素-样生长因子1 (IGF-I)、白介素20受体、α (IL-20 R α )、含有三 环域的跨膜蛋白2 (Kremen-2)、潜在转化生长因子β结合蛋白1 (潜在TGF-β bpl)、晶 状体纤维的主要内在蛋白(MIP-2)、MSP β-链、骨保护素/ TNFRSF11B (肿瘤坏死因子受 体超家族、成员lib)、可溶的gpl30 (sgpl30)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(骨结合素) (SPARC)，及其任意组合。
18.根据权利要求14至17中任一项的药物组合物，其中所述肝细胞生长因子(HGF)是 在1-100 ng/ml的浓度，白介素6 (IL-6)是在10- 200 ng/ml的浓度，白介素8 (IL-8) 是在彡35 ng/ml的浓度。
19.根据权利要求15至18中任一项的药物组合物，其中所述血管内皮生长因子 (VEGF)是在 10- 400 ng/ml 的浓度。
20.根据权利要求16至19中任一项的药物组合物，其中所述巨噬细胞刺激蛋白(MSP) 是在1-100 pg/ml的浓度。
21.根据权利要求18至20中任一项的药物组合物，其被浓缩了至少5倍、优选至少10 倍、更优选至少20倍、甚至更优选至少25倍。
22.根据权利要求18至20中任一项的药物组合物，其被稀释了至少5倍、优选至少10 倍、更优选至少20倍、甚至更优选至少25倍。
23.根据权利要求14至22中任一项的药物组合物用于制备治疗损伤或器官衰竭的药 物的用途。
24.根据权利要求23的用途，其中所述器官是肝或肾。
25.根据权利要求23或M的用途，其中所述药物适合施用0.01-1mg/kg的肝细胞 生长因子(HGF)剂量、0. 01-1 mg/kg的白介素6 (IL-6)剂量、0. 01_1 mg/kg的白介素8 (IL-8)剂量、和任选的0.01-1 mg/kg的血管内皮生长因子(VEGF)剂量。
全文摘要
本发明属于再生医学领域。已经发现，非卵圆的多能肝祖细胞的条件培养基发挥组织再生作用。因此，不含细胞的条件培养基制品可用于治疗损伤和器官衰竭、优选肝和/或损伤或衰竭。
文档编号A61K35/12GK102119031SQ200980131229
公开日2011年7月6日 申请日期2009年6月11日 优先权日2008年6月11日
发明者特塔 C., 卡姆西 G., B. 赫雷拉桑切斯 M., 方萨托 V. 申请人:弗雷森纽斯医疗护理德国有限责任公司