本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及二代测序样品前处理的引物和方法以及试剂盒。技术背景随着分子生物学、遗传学等学科的发展，传统的sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对基因组测序，需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术应运而生。第二代测序技术也称深度测序、大规模平行测序，其核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定dna的序列，synthesis)，例如，在合成新dna互补链时，加入的dntp通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，或者直接加入被荧光标记的dntp或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号，通过荧光信号分析获得互加入碱基信息。现有的技术平台主要包括roche的454平台、illumina公司的solexagenomeanalyzer、appliedbiosystems的solidsystem以及lifetechnologies的pgm平台。二代测序是一项新的低成本，高通量，高准确度的快速测序技术，在科学研究和临床检测方面都有着广泛的应用。无论何种测序平台在测序前都要对样本进行处理，建立基因文库。不同的测序平台基因文库构建方法会有些差异，但基本可概括为以下几个步骤：获取基因组dna，基因组dna片段化，末端修复，连接接头，dna片段选择，pcr扩增，扩增产物鉴定回收及纯化，纯化产物大小和浓度测定，符合要求的基因文库根据不同的测序平台要求制备测序模板，随后进行测序。常规的建库方法都需要较高浓度的起始核酸量，且操作步骤繁琐，需要经过预处理才能将测序接头连接到目的基因片段上，随后进行pcr扩增富集，费时费力，且接头连接效率直接影响构建文库的质量，所以并不适用于大规模临床样本及微量核酸样本的快速建库。因此，迫切需要一种能够简便、高效、快速和准确的建库方法，不仅适用于足量核酸样本的快速建库，同时可对特定的少量细胞群样本进行测序和突变分析，如特殊区域肿瘤组织细胞或血液中的循环肿瘤细胞等。技术实现要素：本发明的目的之一是提供一种接头序列，该接头序列可与包括但不限于扩增目标基因片段的引物以及转座子识别序列连接，可以通过pcr扩增或转座酶复合体直接添加到目标基因片段的两端，构建测序文库。实现上述目的的技术方案如下：一种接头序列，其选自seqidno：1—seqidno：20中的至少两条。本发明的另一目的是提供一种标签接头。实现上述目的的技术方案如下：一种标签接头，包括正向标签接头和反向标签接头，针对同一样品来源的标签接头包括有正向标签接头和反向标签接头，每条标签接头由5’的权利要求1所述的接头序列以及3’的用于表征样本来源的dna标签序列组成，针对同一样品来源的标签接头中的接头序列不相同，同一样品来源的目标基因片段对应的dna标签序列相同，且dna标签序列中避免出现3个或3个以上单碱基重复序列；其gc含量在40％～60％之间；不同的dna标签序列之间不存在非特异性结合；dna标签与接头序列组合成标签接头后，内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构；dna标签中不出现与接头序列相似度大于80％的序列。在其中一个实施例中，所述dna标签选自seqidno：21—seqidno：50中的至少一条，针对同一样品来源的目标基因片段对应的dna标签序列相同。本发明的另一目的是提供一种接头pcr引物。实现上述目的的技术方案如下。一种接头pcr引物，包括正向接头pcr引物和反向接头pcr引物，每条引物由上述标签接头以及连接于标签接头3’端的连接序列构成，所述连接序列可将标签接头直接添加到目标基因片段的两端，从而构建测序文库。连接序列包括但不限于扩增目标基因片段的引物或转座子识别序列。在其中一个实施例中，所述连接序列为针对全基因组预扩增引物的5’端非简并区的seqidno：51，或所述连接序列为针对细菌tn5转座子的seqidno：52；或所述连接序列为选自针对cdh1基因的seqidno：53和seqidno：54，针对egfr基因的seqidno：55和seqidno：56，针对her2基因的seqidno：57和seqidno：58，针对kras基因的seqidno：59和seqidno：60，针对tp53基因的seqidno：61和seqidno：62中的至少一对。本发明的另一目的是提供一种接头pcr引物构建测序文库的方法。实现上述目的的技术方案如下。一种接头pcr引物构建测序文库的方法，主要包括以下步骤：a、提取样本中的dna；b、根据上述接头pcr引物，将所述标签接头直接连接到的目标基因片段的两端，针对每种不同待测样本的接头pcr引物中dna标签序列不同；c、pcr扩增富集目标产物，对目标基因扩增产物进行片段大小筛选和回收纯化，并将不同待测样本的目标基因扩增产物混合，构成核酸测序文库。在其中一个实施例中，所检测的样品数量为1-30个。在其中一个实施例中，所检测的样品数量为30个。本发明的另一目的是提供一种高通量测序的方法。实现上述目的的技术方案如下。一种高通量测序的方法，主要包括以下步骤：a、采用上述接头pcr引物构建测序文库的方法，构建核酸测序文库；b、对核酸测序文库进行片段大小检测和定量，确定测序稀释量。c、测序仪测序，以确定所述核酸测序文库的序列信息。本发明的另一目的是提供一种接头pcr引物构建测序文库的试剂盒。实现上述目的的技术方案如下。一种构建测序文库的试剂盒，包含有：针对不同样本的不同接头pcr引物组；所述每一组接头pcr引物包含有至少一对接头pcr引物对，针对同一样品来源的接头pcr引物包括有正向接头pcr引物和反向接头pcr引物，每条接头pcr引物由标签接头和连接序列组成，所述标签接头由接头序列和dna标签序列组成，所述同一接头pcr引物组的dna标签序列相同，不同接头pcr引物组的dna标签序列不同；每组接头pcr引物的接头序列选自seqidno：1—seqidno：20中的至少两条，dna标签序列选自seqidno：21—seqidno：50；所述连接序列针对全基因组预扩增引物的5’端非简并区的序列，和/或所述连接序列为针对转座子识别序列连接而成，所述转座子识别序列可与相应的转座子序列发生特异性结合,和/或所述连接序列为扩增特定基因的特异性引物。在其中一个实施例中，所述连接序列为针对全基因组预扩增引物的5’端非简并区的seqidno：51，或所述连接序列为针对细菌tn5转座子的seqidno：52；或所述连接序列为选自针对cdh1基因的seqidno：53和seqidno：54，或针对egfr基因的seqidno：55和seqidno：56，针对her2基因的seqidno：57和seqidno：58，针对kras基因的seqidno：59和seqidno：60，针对tp53基因的seqidno：61和seqidno：62中的至少一对。在其中一个实施例中，有30组接头pcr引物，每组接头pcr引物中的接头序列选自seqidno：1—seqidno：20中的两条；该30组接头pcr引物中的dna标签序列选自seqidno：21—seqidno：50，每组内接头pcr引物的dna标签序列相同，而每组间的接头pcr引物的dna标签序列各不相同。本发明的主要优点在于：1.本发明提供的由接头序列、dna标签系列以及连接序列构成的接头pcr引物，能够一次性在目标基因片段两端加上测序接头、样品标签和扩增引物，随后通过pcr富集即可得到测序文库，从而避免了常规建库过程中基因组dna打断、纯化、末端修复、纯化、加a尾、纯化和接头连接的步骤，操作过程简单快速，避免了反复多次操作及接头连接效率等诸多不稳定因素对构建文库质量的影响，减少了实验操作的时间和试剂费用，大大提高了检测准确率。2.本发明所设计的接头pcr引物具有非常好的特异性，接头序列与dna标签序列组合成标签接头后，内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构；所设计的连接序列之间不存在非特异性结合，与标签接头组合形成接头pcr引物后，相互之间不形成二聚体、不存在错配、与pcr产物之间均不存在非特异性结合。3.本发明对起始核酸样本量的需求远远低于常规建库方法，可同时适用于单细胞、微量细胞和多细胞样本的测序文库构建，大大推进了临床上来源少但其序列分析具有重要意义的样本基因序列和突变分析，如特定区域微小肿瘤组织细胞或外周血中的循环肿瘤细胞。4.本发明的检测方法步骤简单，根据不同的检测目的，可选择不同数量和种类的连接序列组成多重pcr引物，通过一步pcr扩增即可完成一个样品中多种目标检测序列的扩增，并使其扩增产物均带上一个特定的dna标签，通过将带有不同标签的不同样品pcr产物混合，实现一次检测多个样品多种pcr产物的并行检测，体现了精确的同时定性、定量分析特征。5.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％，所提供的标签接头与连接序列形成一个特异性、灵敏度和重复性之间达到优化、平衡的检测产品，一次检测能够准确区分多种样本来源的多条碱基序列，实现多样本多基因的并行检测。6.本发明所提供的检测方法所需要的起始核酸量和操作时间远远低于常规测序技术，特别适用于临床检测和科学研究。具体实施方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本实施方式提供一种接头序列，针对同种样品来源的目标基因选自seqidno：1—seqidno：20中的两条。本实施方式还提供一种标签接头，包括正向标签接头和反向标签接头，每条标签接头由5’的上述接头序列以及3’的dna标签序列组成，每条标签接头由5’的权利要求1所述的接头序列以及3’的用于表征样本来源的dna标签序列组成，同一样品来源的目标基因片段对应的dna标签序列相同，且dna标签序列中避免出现3个或3个以上单碱基重复序列；其gc含量在40％～60％之间；不同的dna标签序列之间不存在非特异性结合；dna标签与接头序列组合成标签接头后，内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构；dna标签中不出现与接头序列相似度大于80％的序列。所述dna标签序列为随机的一小段碱基序列，用于区分不同的样本，随机碱基的数目可根据实际需求设计。同一样品来源的目标基因片段对应的dna标签序列相同，从而通过dna标签精确地表征dna的样本来源，并通过将多个不同样本来源的目标基因产物(带有不同的dna标签)混合成一个文库，从而实现一次测序中完成多个样品的高通量测序。在一优选的实施方式中，所述dna标签选自seqidno：21—seqidno：50中的至少一条，针对同一样品来源的目标基因片段对应的dna标签序列相同，不同样品来源的目标基因片段对应的dna标签序列不相同。本实施方式还提供一种接头pcr引物，包括正向接头pcr引物和反向接头pcr引物，每条引物由上述标签接头以及连接于标签接头3’端的连接序列构成，所述连接序列可将标签接头直接添加到目标基因片段的两端，从而构建测序文库。连接序列包括但不限于扩增目标基因片段的引物或转座子识别序列。在一优选的实施方式中，连接序列为全基因组预扩增引物的5’端非简并区，通过pcr扩增直接将标签接头添加到测序基因片段的两端，目标片段筛选纯化后，直接得到测序文库。在一优选的实施方式中，连接序列为转座子识别序列，所述转座子识别序列可与相应的转座子序列发生特异性结合，通过与相应的转座酶构建转座酶复合体，在打断基因组dna片段的同时直接将标签接头添加到测序基因片段的两端，pcr扩增富集，目标片段筛选纯化后，直接得到测序文库。在一优选的实施方式中，连接序列为扩增特定基因的特异性引物，通过特异性引物对特定基因扩增的同时直接将标签接头添加到特定基因片段的两端，目标片段筛选纯化后，直接得到测序文库。在一优选的实施方式中，所述连接序列为针对全基因组预扩增引物的5’端非简并区的seqidno：51，或所述连接序列为针对细菌tn5转座子的seqidno：52；或所述连接序列为选自针对cdh1基因的seqidno：53和seqidno：54，针对egfr基因的seqidno：55和seqidno：56，针对her2基因的seqidno：57和seqidno：58，针对kras基因的seqidno：59和seqidno：60，针对tp53基因的seqidno：61和seqidno：62中的至少一对。本实施方式还提供一种接头pcr引物构建测序文库的方法，主要包括以下步骤：a、提取样本中的dna；b、根据上述接头pcr引物，将所述标签接头直接连接到的目标基因片段的两端，针对每种不同待测样本的接头pcr引物中dna标签序列不同；c、pcr扩增富集目标产物，对目标基因扩增产物进行片段大小筛选和回收纯化，并将不同待测样本的目标基因扩增产物混合，构成核酸测序文库。所检测的样品数量为1-30个。更优选的，所检测的样品数量为30个。根据接头pcr引物构建测序文库的方法，本实施方式还提供一种的高通量测序的方法，包括以下步骤：a、采用上述接头pcr引物构建测序文库的方法，构建核酸测序文库；b、对核酸测序文库进行片段大小检测和定量，确定测序稀释量。c、测序仪测序，以确定所述核酸测序文库的序列信息。本实施方式还提供一种构建测序文库的试剂盒，包含有：针对不同样本的不同接头pcr引物组；所述每一组接头pcr引物包含有至少一对接头pcr引物对，接头pcr引物由标签接头和连接序列组成，所述标签接头由接头序列和dna标签序列组成，所述同一接头pcr引物组的dna标签序列相同，不同接头pcr引物组的dna标签序列不同；每组接头pcr引物的接头序列选自seqidno：1—seqidno：20中的至少两条，dna标签序列选自seqidno：21—seqidno：50；所述连接序列针对全基因组预扩增引物的5’端非简并区的序列，和/或所述连接序列为针对转座子识别序列连接而成，所述转座子识别序列可与相应的转座子序列发生特异性结合,和/或所述连接序列为扩增特定基因的特异性引物。以下通过具体的实施例，做本发明做进一步的阐述。实施例1二代测序样品前处理的引物一、接头序列本发明设计了特异性高的接头序列，见表1。表1接头序列名称碱基序列(5’→3’)seqidno.a1接头cagtcctagtgacaagtcgactc1a2接头cgcattgaccagtacagtcctaga2a3接头accgtgactgtcgaactgatcga3a4接头cacgttcggaatgccttacgtact4a5接头agtccttgaatcgctaagcgctcg5a6接头caagtcgatagcgaatctgacct6a7接头cttgaacgtcagtcaagctcgca7a8接头cgtatggacttgacctgcatggac8a9接头aagtcggtcagccttgagtaccg9a10接头cggatcgaacgtacctatgcgaa10a11接头cctagttcgatccgtgcgactga11a12接头attgccatgtacggtaactgcatc12a13接头acatggtcaatgcctatgcaactc13a14接头cactgaactgatccaatgcatagg14a15接头cgtaagtccatgctagcttaccta15a16接头attgcgatcctgatcgatgaccga16a17接头ccatgatgcacggattctgaatg17a18接头cagattcggatcgtgaactgactc18a19接头acctgcttgtacggatgaaccga19a20接头ctagtgaccgtaaccatgcggatg20针对同一样品来源的标签接头，可选择其中的两条。二、dna标签和标签接头本发明所用的dna标签为随机的一小段碱基序列，用于区分不同的样本，随机碱基的数目可根据实际需求设计。针对每一个样本，其中的每对接头序列中的至少一条3’端与一种特定的dna标签相连接，从而形成标签接头，通过标签接头与目标基因片段的连接，使同一样品来源的目标基因片段带上相应的dna标签，从而通过dna标签精确地表征dna的样本来源，并通过将多个不同样本来源的目标基因产物(带有不同的dna标签)混合成一个文库，从而实现一次测序中完成多个样品的高通量测序。针对同一检测样品的标签接头包括有正向标签接头和反向标签接头，每条标签接头由两部分组成，即5’的接头序列和3’的dna标签。针对同一样品来源的标签接头中的接头序列不相同，但是dna标签相同，如下所示。正向标签接头＝5’-接头序列1-dna标签-3’端反向标签引物＝5’-接头序列2-dna标签-3’端。针对不同样品来源的标签接头中的接头序列可以相同，可以选自上述表1中的seqidno.1—20.本发明所设计的dna标签，满足以下条件，具体为：1)标签序列中避免出现3个或3个以上单碱基重复序列；2)标签序列的gc含量在40％～60％之间；3)不同的dna标签序列之间不存在非特异性结合；4)标签序列与接头序列组合成标签接头后，内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构；5)标签序列中避免出现与接头序列相似度大于80％的序列。本发明在满足上述条件的基础上，设计了30条分辨率好的dna标签，见表2。dna标签通过与接头序列相连接，组成相应的标签接头。表2dna标签序列三、连接序列和接头pcr引物本发明所使用的连接序列，可以直接将标签接头添加到目标基因片段的两端。针对同一种样品来源的接头pcr引物组，包括有正向接头pcr引物和反向接头pcr引物，每条接头pcr引物由标签接头和连接序列组成，连接序列包括但不限于扩增目标基因片段的引物以及转座子识别序列。正向接头pcr引物＝5’-正向标签接头-正向连接序列-3’端反向接头pcr引物＝5’-反向标签接头-反向连接序列-3’端本发明在满足上述条件的基础上，设计了3种类型的连接序列，分别为：1)全基因组预扩增引物的5’端非简并区，通过pcr扩增直接将标签接头添加到测序基因片段的两端，具体优选序列如seqidno.51；2)转座子识别序列，可与相应的转座子序列发生特异性结合通过与相应的转座酶构建转座酶复合体，在打断基因组dna片段的同时直接将标签接头添加到测序基因片段的两端，转座子识别序列根据不同转座子重复序列可有多种选择，本实施例优选可与细菌tn5转座子特异性结合的识别序列，具体优选序列如seqidno.52；3)扩增特定基因的特异性引物，通过特异性引物对特定基因扩增的同时直接将标签接头添加到特定基因片段的两端，本实施例优选扩增cdh1、egfr、her2、kit、tp53基因。连接序列1、2和3分别见表3、4和5。表3连接序列1seqidno.序列碱基(5’→3’)51gtacttcgaccgatcatgc表4连接序列2表5连接序列3实施例2二代测序样品前处理的试剂盒本实施例所述试剂盒，有3种类型，都由不同的连接序列构成的接头pcr引物。其中，本实施例所述使用连接序列1构建接头pcr引物的试剂盒a，主要包括有：一、针对不同样品的不同接头pcr引物组所述接头pcr引物序列组成从5’到3’端依次为接头序列、dna标签序列和连接序列1。同一试剂盒中所有接头pcr引物选用的接头序列相同，本实施例接头序列选自实施例1接头序列(表1)中的2条；同一引物组的dna标签序列相同，不同引物组的dna标签序列不同，本实施例dna标签序列选自实施例1中的dna标签序列(表2)；本实施中连接序列选自实施例1中的连接序列1(见表3)。本实施例中，所述的二代测序样品前处理试剂盒共有30组接头pcr引物，每组接头pcr引物包含有实施例1表1中的2条接头序列，2条接头序列的3’端均引入相同的dna标签序列，从而形成标签接头，2条标签接头的3’端均引入连接序列1(seqidno.51)。每组接头pcr引物可分别对应于一个待检测样本，其中，第一个样本使用一种dna标签序列，从而形成第一个样本的接头pcr引物组；第二个样本使用另一种dna标签序列，从而形成第二个样本的接头pcr引物组；如此类推，不同样本的接头pcr引物使用不同的dna标签进行标记，并形成与待检测样本一一对应的接头pcr引物组。接头pcr引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条序列分别用10mmol/ltrisbuffer配制成100pmol/ml的贮存液，其中，每种标签贮存液分开保存，并做好标记。其中，本实施例所述使用连接序列2构建接头pcr引物的试剂盒b，主要包括有：一、针对不同样品的不同接头pcr引物组所述接头pcr引物序列组成从5’到3’端依次为接头序列、dna标签序列和连接序列2。同一试剂盒中所有接头pcr引物选用的接头序列相同，本实施例接头序列选自实施例1接头序列(表1)中的2条；同一引物组的dna标签序列相同，不同引物组的dna标签序列不同，本实施例dna标签序列选自实施例1中的dna标签序列(表2)；本实施中连接序列选择实施例1中的连接序列2(见表4)。本实施例中，所述的二代测序样品前处理试剂盒共有30组接头pcr引物，每组接头pcr引物包含有实施例1表1中的2条接头序列，2条接头序列的3’端均引入相同的dna标签序列，从而形成标签接头，2条标签接头的3’端均引入有连接序列2(seqidno.52)。每组接头pcr引物可分别对应于一个待检测样本，其中，第一个样本使用一种dna标签序列，从而形成第一个样本的接头pcr引物组；第二个样本使用另一种dna标签序列，从而形成第二个样本的接头pcr引物组；如此类推，不同样本的接头pcr引物使用不同的dna标签进行标记，并形成与待检测样本一一对应的接头pcr引物组。接头pcr引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条序列分别用10mmol/ltrisbuffer配制成100pmol/ml的贮存液，其中，每种标签贮存液分开保存，并做好标记。其中，本实施例所述使用连接序列3构建接头pcr引物的试剂盒c，主要包括有：一、针对不同样品的不同接头pcr引物组所述接头pcr引物序列组成从5’到3’端依次为接头序列、dna标签序列和连接序列3。同一试剂盒中所有接头pcr引物选用的接头序列相同，本实施例接头序列选自实施例1接头序列(表1)中的2条；每一组接头pcr引物对中至少一条包含有dna标签序列，同一引物组的dna标签序列相同，不同引物组的dna标签序列不同，本实施例dna标签序列选自实施例1中的dna标签序列(表2)；本实施中连接序列选择实施例1中的连接序列3(见表5)。本实施例中，所述的二代测序样品前处理试剂盒共有30组接头pcr引物，每组接头pcr引物包含实施例1表1中的2条接头序列，2条接头序列的3’端均引入相同的dna标签序列，从而形成标签接头，2条标签接头的3’端均引入相应的连接序列3(seqidno.53-seqidno.62)，每组接头pcr引物都包含有实施例1表5连接序列3中的全部序列。每组接头pcr引物可分别对应于一个待检测样本，其中，第一个样本使用一种dna标签序列和表5中所有的连接序列，从而形成第一个样本的接头pcr引物组；第二个样本使用另一种dna标签序列和表5中所有的连接序列，从而形成第二个样本的接头pcr引物组；如此类推，不同样本的接头pcr引物使用不同的dna标签进行标记，并形成与待检测样本一一对应的接头pcr引物组。以一个样本使用a1接头、a2接头和dna标签序列seqidno.21为例，这个样本的接头pcr引物组包含10条接头pcr引物，具体组成如表6所示：表6一个样本接头pcr引物组组成接头pcr引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条序列分别用10mmol/ltrisbuffer配制成100pmol/ml的贮存液，其中，每种标签贮存液分开保存，并做好标记。实施例3使用实施例2中的试剂盒a对样品进行检测本实施例用实施例2中的试剂盒a对20例样本进行检测，20例样品分别来源于肺癌细胞系nci-h1975、前列腺癌细胞系lncap、胃癌细胞系hgc-27、乳腺癌细胞系mcf-7、肝癌细胞系hepg2和阴性对照淋巴母细胞ccrf-hsb-2，本领域技术人员只要知道细胞系名称就可向公司购买获得。每种细胞系各设置5个重复，组成30例检测样本，样本编号及对应的接头pcr引物如表7所示。表7样本对应接头pcr引物一、样本dna的提取将上述各种备用的细胞系制备5个重复，形成表7中的30例检测样本。用biovision的genomicdnaisolationkit(货号：k281-50)提取基因组dna，操作步骤严格按说明书进行。二、接头pcr引物扩增全基因组dna1、预扩增本实施例采用简并引物对全基因组进行预扩增，简并引物包含两个部分：5’端非简并区和3’端简并区。本实施例优选如下简并引物：5’-gtacttcgaccgatcatgcnnnnnnnnnn-3’，n可为碱基a、t、g和c中的任意一种,gtacttcgaccgatcatgc为二次扩增接头pcr引物的连接序列。预扩增引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后用10mmol/ltrisbuffer配制成100pmol/ml的贮存液，并做好标记，经无核酶ddh2o稀释成10um得到工作液。按如下成分配置50ul预扩增体系：体系配置好后混匀，盖好离心管盖，瞬时离心。随后进行pcr扩增，反应按以下程序进行：2、接头pcr引物扩增本实施例样本使用表6中对应的接头引物pcr，接头pcr引物工作液是由正向接头pcr引物和反向接头pcr引物储存液各取相同体积混合均匀所得。预扩增结束后，向产物中加入2ul接头pcr引物工作液，混匀后盖好离心管盖，瞬时离心。随后进行pcr扩增，反应按以下程序进行：将30例样本的富集产物混合，并进行2.5％的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收大小为200-316bp的片段，纯化后做好标记，纯化产物置于4℃保存备用。四、文库检测上述纯化后的pcr产物，用agilentbioanalyzer2100或q-pcr检测片段大小及文库浓度。五、使用ionprotontm制备测序模板根据ionprotontm测序仪配套试剂盒，使用步骤四所得测序文库制备测序模板，具体操作，参看产品说明书。六、上机测序严格按照仪器操作说明书进行测序操作，本实施例中采用pi芯片，在芯片中加载酶、测序引物和制备好的测序模板等，测序过程约2.5个小时，便可得到测序序列信息。七、测序结果的分析根据接头序列和dna标签序列与样品1-30的对应关系，将每个样品测序所得的数据进行统计分析，结果见表8。表8样本检测结果从样本检测结果可知，使用本发明试剂盒制备的测序文库质量高且效果稳定，能达到很好的比对率，且唯一比对率在90％左右。实施例4使用实施例2中的试剂盒b对样品进行检测本实施例用实施例2中的试剂盒b对样本31-60进行检测，30例样品分别来源于肺癌细胞系nci-h1975、前列腺癌细胞系lncap、胃癌细胞系hgc-27、乳腺癌细胞系mcf-7、肝癌细胞系hepg2和阴性对照淋巴母细胞ccrf-hsb-2，本领域技术人员只要知道细胞系名称就可向公司购买获得。每种细胞系各设置5个重复，组成30例检测样本，样本编号及对应的接头pcr引物如表9所示。表9样本对应接头pcr引物一、样本dna的提取将上述各种备用的细胞系制备5个重复，形成表9中的30例检测样本。用biovision的genomicdnaisolationkit(货号：k281-50)提取基因组dna，操作步骤严格按说明书进行。二、转座酶复合体组装本实施例以细菌en-tn5转座酶复合体为例，相应样本使用表8中对应的接头引物pcr，正向接头pcr引物和反向接头pcr引物工作液分别由正向接头pcr引物和反向接头pcr引物储存液经无核酶ddh2o稀释成20um所得。tn5转座子反向重复序列为5’-ctgtctcttatacacatct-3’，序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的序列分别用10mmol/ltrisbuffer配制成100pmol/ml的贮存液，经无核酶ddh2o稀释成20um得到工作液。1、正向接头pcr引物和反向接头pcr引物分别与ez-tn5转座子序列退火形成双链。取两支200ul的pcr反应管，按如下成分配置体积为50ul的反应体系：体系配置好后混匀，盖好离心管盖，瞬时离心。随后按以下程序进行退火反应：95℃，5min；以0.1℃/min的降温速度使温度降至4℃。经上述反应可得到用于转座酶复合体组装的正向接头pcr引物双链和反向接头pcr引物双链。2、en-tn5转座酶复合体组装。取一支200ul的pcr反应管，按如下成分配置体积为5ul的反应体系：体系配置好后混匀，盖好离心管盖，瞬时离心，随后于25℃反应20min。经上述反应得到的en-tn5转座酶复合体可用于在打断基因组dna的同时将正向接头pcr引物和反向接头pcr引物连接到dna片段的两端。三、接头pcr引物连接到dna片段的两端利用en-tn5转座酶复合体打断步骤一中提取得到的基因组dna，在打断的同时将正向接头pcr引物和反向接头pcr引物连接到dna片段的两端。取一支200ul的pcr反应管，按如下成分配置打断体系：体系配置好后混匀，盖好离心管盖，瞬时离心，随后于55℃反应10min。打断产物纯化后溶于20ul无核酶ddh2o中，于4℃保存备用。四、产物富集向上述纯化打断产物中加入以下反应试剂，其中pcr富集引物1为a1接头前20bp序列：5’-cagtcctagtgacaagtcga-3’，pcr富集引物2为a2接头前20bp序列：5’-cgcattgaccagtacagtcc-3’，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条序列分别用10mmol/ltrisbuffer配制成100pmol/ml的贮存液，并做好标记。混匀后盖好离心管盖，瞬时离心。随后进行pcr扩增，反应按以下程序进行：将30例样本的富集产物混合，并进行2.5％的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收大小为200-316bp的片段，纯化后做好标记，纯化产物置于4℃保存备用。五、文库检测上述纯化后的pcr产物，用agilentbioanalyzer2100或q-pcr检测片段大小及文库浓度。六、使用ionprotontm制备测序模板根据ionprotontm测序仪配套试剂盒，使用步骤四所得测序文库制备测序模板，具体操作，参看产品说明书。七、上机测序严格按照仪器操作说明书进行测序操作，本实施例中采用pi芯片，在芯片中加载酶、测序引物和制备好的测序模板等，测序过程约2.5个小时，便可得到测序序列信息。八、测序结果的分析根据接头序列和dna标签序列与样品31-60的对应关系，将每个样品测序所得的数据进行统计分析，结果见表10。表10样本检测结果由上述检测结果可知，使用本发明试剂盒制备的测序文库质量高且效果稳定，能达到很好的比对率，且唯一比对率在90％左右。实施例5使用实施例2中的试剂盒c对样品进行检测本实施例用实施例2中的试剂盒c对30例肿瘤患者临床血液样本中的ctc进行检测，样本编号及对应的接头pcr引物如表11所示。表11样本对应接头pcr引物一、ctc分离纯化和基因组dna提取肿瘤患者临床血液样本中的ctc可通过购买ctc分离纯化试剂盒得到，其基因组dna的提取可参考分子克隆教材中的实验步骤。也可通过以下操作步骤进行：1、取7.5ml肿瘤患者外周血，加入红细胞裂解液去除红细胞。2、通过磁性分离得到血液中的ctc，所用磁珠上包被有以下特异性针对ctc表面标记抗原的单克隆抗体：epcam、e-cadherin、ck18、ck19、n-cadherin、vimentin、fibronectin、akt2。3、向上述分离得到的ctc细胞中加入5ul细胞裂解液，混匀后瞬时离心，于50℃裂解20min，95℃孵育4min，即得到基因组dna，基因组dna保持在4℃备用。二、接头pcr引物组扩增配制接头pcr引物组工作液：针对每个样本的接头pcr引物组，分别取5对带有同一dna标签的接头pcr引物贮存液10ul于同一1.5ml微量离心管中，这5对接头pcr引物的连接序列分别为扩增cdh1、egfr、her2、kit、tp53基因的特异性引物，混合均匀即为每一例样本的接头pcr引物组工作液。则可组装成30管接头pcr引物组工作液，每一管中的接头pcr引物上dna标签序列相同，与表11中的样本相对应。按如下成分配置体积为50ul的pcr反应体系如下：混匀后盖好离心管盖，瞬时离心，随后进行pcr扩增，反应按以下程序进行：将30例样本的富集产物混合，并进行2.5％的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收大小为200-316bp的片段，纯化后做好标记，纯化产物置于4℃保存备用。三、文库检测上述纯化后的pcr产物，用agilentbioanalyzer2100或q-pcr检测片段大小及文库浓度。四、使用ionprotontm制备测序模板根据ionprotontm测序仪配套试剂盒，使用步骤四所得测序文库制备测序模板，具体操作，参看产品说明书。五、上机测序严格按照仪器操作说明书进行测序操作，本实施例中采用pi芯片，在芯片中加载酶、测序引物和制备好的测序模板等，测序过程约2.5个小时，便可得到测序序列信息。六、测序结果的分析根据接头序列和dna标签序列与样品61-90的对应关系，将每个样品测序所得的数据与直接测序法进行对比，计算本发明所提供的检测结果的吻合率。具体的测序结果如表12所示：表12样本检测结果本方法检测30份样本的全基因组序列信息与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的接头pcr引物能够在检测过程中准确地检测出30个样品的5个基因的突变类型，且结果稳定可靠。实施例6本发明不同接头序列对试剂盒测序结果的影响一、接头序列的选择本实施例将研究本发明所述不同接头序列与dna标签和连接序列组成不同的接头pcr引物时，对检测效果的影响。本实施例以试剂盒c检测5例肿瘤患者临床血液标本中ctc的基因突变为例，使用表1中不同的接头序列，分别与表2中的dna标签序列和表3中的全部连接序列，构建接头pcr引物，具体实验组设计如表13所示。表13选择不同的接头序列对测序结果的影响二、样本检测采用上述设计制备的试剂盒，按实施例5所述检测过程和方法对样本91-95进行检测，将每个样本检测结果与直接测序法进行对比，计算本发明所提供的检测结果的吻合率，检测结果如表14所示：表14选择不同接头序列的检测结果由以上检测结果可知，使用本发明提供的不同接头序列对样本进行检测的结果与直接测序法检测结果吻合率均为100％，说明本发明接头pcr引物中接头序列的选择对样本检测结果没有影响，使用本发明提供的20条接头序列中任何一条构建的接头pcr引物均能准确对样本进行测序。使用本发明提供的其他接头序列构建的试剂盒对检测结果的影响与本实施例一致，具体实验数据省略。实施例7不同dna标签序列对测序结果的影响一、dna标签序列的选择本实施例将研究本发明所述不同dna标签序列与接头序列和连接序列组成不同的接头pcr引物时，其对检测效果的影响。本实施例以试剂盒c检测5例肿瘤患者临床血液样本中ctc的基因突变为例，使用表2中不同的dna标签序列，分别与表1中的接头序列a1和a2和表3中的全部连接序列，构建接头pcr引物，具体实验组设计如表15所示。表15选择不同的dna标签序列对测序结果的影响二、样本检测采用上述设计制备的试剂盒，按实施例5所述检测过程和方法对样本96-100进行检测，将每个样本的检测结果与直接测序法进行对比，计算本发明所提供的检测结果的吻合率，检测结果如表16所示：表16选择不同dna标签序列的检测结果由以上检测结果可知，使用不同dna标签对样本进行检测的结果与直接测序法检测结果吻合率均为100％，说明本发明的接头pcr引物中dna标签序列的选择对样本检测结果没有影响，任何严格按照本发明dna标签序列设计原则所设计出的dna标签序列构建的接头pcr引物均能准确对样本进行测序。其他类型试剂盒以及dna标签序列的选择对检测结果的影响与本实施例一致，具体实验数据省略。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12