一种RNA恒温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种RNA恒温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的试剂盒及检测方法。适用于临床常见致病细菌的菌种鉴定，可以为临床细菌感染患者合理地进行抗菌药物治疗提供指导。

背景技术：

细菌感染是临床常见的感染性疾病，其发病率和死亡率高，如果得不到早期的诊断和治疗，会严重危及患者的生命。从临床样本中直接分离得到细菌表示感染严重需要立即进行抗菌治疗。不同的致病菌对药物种类和浓度的敏感性不同，治疗成功的关键在于早期应用合适足量的药物。而传统的检测致病菌的方法如显微镜检查、培养法、生物化学检查和免疫学方法等，由于各种因素的影响，通常需要几种方法联合使用，而且耗时也较长，需要1～3d，这期间用药不当往往使得患者病情加重或增加菌株耐药性。特别是在多种细菌联合感染的情况下，更增加了菌种鉴定和用药的复杂性。因此，建立一种快速且特异性强的微生物检测方法是十分必要的。

PCR方法是近年来发展起来的诊断技术，这种技术快速、灵敏，在临床微生物检测方面获得了极为广泛的应用；但是PCR检测方法也存在一些不足，如检测每一种病原菌都需要特异性引物，因而每次反应只能确定一种病原菌的有无，这种“一对一”的模式不适合检测混合感染的复杂标本。临床微生物的检测急需建立一种“一对多”的检测系统，可以通过一次反应检测多种目标病原体。而通过恒温扩增-分子信标探针——一种新兴的高通量检测技术，使得通过一次反应对多种病原菌的同时检测成为可能。

转录介导的核酸扩增技术(Transcription mediated amplification，恒温扩增)是近年来发展起来的一种直接快速检测RNA的等温扩增技术，它克服了以往核酸扩增的不足，更为简便高效，尤其适用于RNA病毒的检测。与PCR不同，恒温扩增是在M-MLV、T7RNA聚合酶两种酶的共同协作下，在41～42℃，由一对引物指导的连续均一的体外特异核苷酸序列等温扩增酶促反应。其中一条引物其5’端具有被T7RNA聚合酶识别的启动子序列。在恒温扩增基础上结合分子信标(molecular beacon)探针建立的等温扩增技术，具有以下优点：⑴等温扩增：反应在同一恒温体系条件下进行；⑵快速高效、灵敏度高:该反应时一种无需升降温的连续快速扩增，也不需RT-PCR反应中第一阶段15～30分钟的反转录过程，整个反应时间短、单链RNA产物积累迅速，可以在30～60分钟内完成检测，一个反应可同时完成对多种临床常见致病细菌的快速鉴定；并使模板RNA扩增10⁹倍以上，灵敏度甚至可以达到检测拷贝数为个位的模板RNA。恒温扩增技术比目前商品化的免疫检测试剂盒敏感10～1000倍，比常规PCR方法也敏感10～100倍；⑶特异性强：反应不需高温变性，即使有双链DNA污染也不会被扩增，而通过分子信标探针进行熔解曲线分析进一步提高了检测的特异性和灵敏度；⑷设计简单：只需设计1对引物和1条探针来识别靶RNA的3个不同区域。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种RNA恒温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用，以解决现有技术中临床常见致病细菌检测方法灵敏度较低，检测周期长、易污染出现假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种RNA恒温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的引物和分子信标探针，包括如下序列：

正向引物F1：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

反向引物R1：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

正向引物F2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

反向引物R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

分子信标探针P1：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

分子信标探针P2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

分子信标探针P3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

所述反向引物R1的5’端的31个碱基是增加的T7噬菌体启动子序列，而3’端20个碱基是与细菌16S rRNA互补的特异性序列；

所述反向引物R2的5’端的31个碱基是增加的T7噬菌体启动子序列，而3’端20个碱基是与细菌16S rRNA互补的特异性序列。

所述分子信标探针P1的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的40个碱基是与细菌16S rRNA反义链互补的特异性序列；

所述分子信标探针P2的5’端和3’端的7个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的34个碱基是与细菌16S rRNA反义链互补的特异性序列；

所述分子信标探针P3的5’端和3’端的7个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的40个碱基是与细菌16S rRNA反义链互补的特异性序列。

其中，所述分子信标探针P1，其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团CY5，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL；

所述分子信标探针P2，其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团HEX，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL；

所述分子信标探针P3，其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL。

一种RNA恒温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的试剂盒，包括如下试剂：2×恒温扩增反应液、5×酶混合液；

其中，2×恒温扩增反应液的配方如下：Tris-HCl pH8.0 80mM、KCl 140mM、MgCl₂24mM、DTT 10mM、dNTP 2mM、NTP 4mM、甜菜碱2M、体积分数为30％的DMSO、正向引物F1 0.4μM、反向引物R1 0.4μM、正向引物F2 0.4μM、反向引物R2 0.4μM、分子信标探针P1 0.05μM、分子信标探针P2 0.05μM、分子信标探针P3 0.1μM。

其中，所述5×酶混合液的配方如下：M-MLV 20U/μl、T7RNA聚合酶100U/μl、BSA 10.5ug/μl。

作为优选该试剂盒包括空白对照，所述空白对照为无核酸酶的DEPC水。

上述RNA恒温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的试剂盒在检测致病细菌中的应用在本发明的保护范围之内。

一种RNA等温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的方法，包括以下步骤：

(1)待测样品RNA的提取；

(2)RNA恒温扩增反应和熔解曲线检测：

取12.5ul 2×恒温扩增反应液，5ul模板RNA溶液，加DEPC水补充至20ul，分别以待测样本、阴性对照(经过核酸提取过程的无菌生理盐水)、空白对照作为模板，加入96孔板反应孔中；

RNA恒温扩增：65℃保温5分钟，41℃保温5分钟；向96孔板反应孔中加入5ul酶混合液，瞬时离心；将96孔板放入荧光定量PCR仪中，41℃反应30分钟；

熔解曲线检测：按照0.14℃/step升温速率，从40℃到75℃逐渐升高温度，熔解曲线分析程序记录每一次升温分子信标产生的荧光值。Melting analysis程序在荧光定量PCR仪(LightCycler 480型，Roche公司)上进行。

本发明试剂盒能够检测临床常见的致病细菌如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌、鲍曼不动杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、普通变形杆菌、表皮葡萄球菌、洋葱克雷伯菌、噬麦芽食单胞菌的16S rRNA，具有特异性高、灵敏度高(可达10³CFU/ml)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及准确(避免假阳性)、快速(常规1小时完成检测)检测的特点，将在临床微生物的快速鉴定和检测分析中发挥重要作用，应用前景广阔。

有益效果：

(1)高特异性、低污染：通过精心设计并结合临床样本筛查优化选择出的特异性正向引物、反向引物和分子信标探针，同步识别临床常见致病细菌的3个不同区域，保证了扩增的特异性；同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。

(2)快速检测:将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降级循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要45分钟；

(3)污染易控：与普通PCR及荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制比较容易；

(4)结果直观明了：反应结束后，根据熔解曲线的Tm值即可确定所检测样本的菌种。

综上所述，本发明试剂盒能够鉴定临床常见致病细菌，具有特异性高、灵敏度高、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(60分钟完成扩增检测)的特点，将在临床微生物早期快速诊断中发挥重要作用。

附图说明

图1几种常见致病细菌RNA恒温扩增检测结果图示其中1奇异变形杆菌 2阴沟肠杆菌 3洋葱克雷伯菌 4阴性对照 5空白对照。

图2临床常见致病细菌RNA恒温扩增检测试剂盒灵敏度测试结果图示其中1为1.5×10⁷CFU/ml菌液提取RNA、2为1.5×10⁶CFU/ml菌液提取RNA、3为1.5×10⁵CFU/ml菌液提取RNA、4为1.5×10⁴CFU/ml菌液提取RNA、5为1.5×10³CFU/ml菌液提取RNA、6为阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1：RNA恒温扩增引物和熔解曲线检测分子信标探针的设计

由于16S rRNA基因序列的保守性和存在的普遍性，应用16S rRNA作为分子指标已逐渐成为微生物检测和分类鉴定的一种强有力工具。分子信标探针的设计思想是：综合考虑对常见致病细菌检测的特异性和通用性、引物和探针设计应遵循的普遍性原则(如Tm值、3’末端自由能、GC含量、避免出现内部结构及形成二聚体等)，以及反向引物加上T7噬菌体启动子序列后的影响等。对于设计出的引物和探针合成回来后再通过20种常见致病细菌的RT-PCR实验和RNA恒温扩增熔解曲线反应实验进行筛选验证，最后本发明优选出如下引物和探针：

正向引物F1：5’-GAAGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(SEQ ID NO：1)

反向引物R1：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTTACTCACCCGTCCGCCACT-3’(SEQ ID NO：2)

正向引物F2：5’-GCAACGCGAAGAACCTTACC-3’(SEQ ID NO：3)

反向引物R2：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGACGACAGCCATGCAGCACCT-3’(SEQ ID NO：4)

分子信标探针P1：5’-GCGCGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACGGACGGGGAGCTTGCCCGCGC-3’(SEQ ID NO：5)

分子信标探针P2：5’-GCCCGTTAGAGATAGAGGCTTCACCTTCGGAGGACAATGTGAACGGGC-3’(SEQ ID NO：6)

分子信标探针P3：5’-CGCGCGG GCCGAACACAAAAAGTTAAGCTTCTTAGCGCCGATTGTAG CCGCGCG-3’(SEQ ID NO：7)

所述反向引物R1、R2的5’端的31个碱基是增加的T7噬菌体启动子序列，而3’端20个碱基是与细菌16S rRNA互补的特异性序列；

所述分子信标探针P1在其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团CY5，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL；P1的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的40个碱基是与细菌16S rRNA反义链互补的特异性序列；

所述分子信标探针P2在其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团HEX，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL；P2的5’端和3’端的7个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的34个碱基是与细菌16S rRNA反义链互补的特异性序列；

所述分子信标探针P3在其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL；P3的5’端和3’端的7个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的40个碱基是与细菌16S rRNA反义链互补的特异性序列；

为保证引物和分子信标探针的质量，委托上海生工生物工程有限公司以HPLC的纯度标准进行合成。

实施例2：临床常见致病细菌RNA恒温扩增熔解曲线法检测体系的建立与优化

针对RNA恒温扩增熔解曲线法检测体系一些重要的影响因素进行条件的优化。

1、方法

(1)Mg²⁺浓度：按照表1的反应体系配制2×恒温扩增反应液，固定其它参数，分别调节Mg²⁺的终浓度至4mM、8mM、12mM、16mM、20mM、24mM，以提取的屎肠球菌总RNA为模板进行恒温扩增等温扩增。实验结束后比较不同Mg²⁺浓度对扩增效率和熔解曲线的影响。

(2)K⁺浓度：按照表1的反应体系配制2×恒温扩增反应液，固定其它参数，分别调节K⁺的终浓度至30mM、50mM、70mM、90mM、110mM、220mM，以提取的屎肠球菌总RNA为模板进行恒温扩增等温扩增。实验结束后比较不同K⁺浓度对扩增效率和熔解曲线的影响。

(3)dNTP/NTP的浓度组合：按照表1的反应体系配制2×恒温扩增反应液，固定其它参数，分别调节dNTP/NTP的终浓度至0.4mM/1.6mM、0.6mM/1.6mM、0.8mM/1.6mM、1mM/1.6mM、0.8mM/2mM、1mM/2mM，以提取的屎肠球菌总RNA为模板进行恒温扩增等温扩增。实验结束后比较不同dNTP/NTP的浓度组合对扩增效率和熔解曲线的影响。

(4)引物和探针的浓度比：按照表1的反应体系配制2×恒温扩增反应液，固定其它参数，分别调节引物和探针的浓度比为1:1、2:1、3:1、4:1，以提取的屎肠球菌总RNA为模板进行RNA等温扩增。实验结束后比较不同引物和探针的浓度比对扩增效率和熔解曲线的影响。

2、结果

针对每个动力学优化实验，系统比较恒温扩增反应所获得的荧光增长曲线情况，结果发现当Mg²⁺浓度选用12mM、K⁺浓度选用70mM、dNTP/NTP的浓度组合选用1mM/2mM、引物和探针的浓度比为4:1时，通过40分钟的RNA等温扩增所得的扩增效果最佳。因此选用上述最优条件确定为试剂盒各组分的组成。

实施例3：临床常见致病细菌(RNA恒温扩增熔解曲线法)试剂盒的组成和检测方法

1、试剂盒的组成(保存于-20℃)

(1)2×恒温扩增反应液：其组分为：80mM Tris-HCl(pH8.0)、140mM KCl、24mM MgCl₂、10mM DTT、2mM dNTP、4mM NTP、Q-solution、0.4μM正向引物F1(F2)、0.4μM反向引物R1(R2)、0.05μM分子信标探针P1(P2)、0.1μM分子信标探针P3；其中正向引物F1是序列编号为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，反向引物R1是序列编号为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，正向引物F2是序列编号为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，反向引物R2是序列编号为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，分子信标探针P1是序列编号为SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，分子信标探针P2是序列编号为SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，分子信标探针P3是序列编号为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；

(2)5×酶混合液：其组分为200U M-MLV逆转录酶、1000U T7RNA聚合酶、105μg BSA；

(3)阴性对照：为无菌生理盐水，在核酸提取时与标本同时平行提取以作为阴性对照使用；

(4)DEPC水：为DEPC处理的无核酸酶的超纯水，作为空白对照使用。

2、方法

(1)提取待测样品的RNA，即模板RNA。

(2)按照以下方法配制反应液：反应总体积为25μl：取12.5μl 2×恒温扩增反应液加入0.2ml光学PCR反应管，再加入5μl样本RNA(或阴性对照和空白对照)，加水补充至20μl，然后轻轻将管盖盖好；

(3)反应预处理：将上述反应管置于恒温浴器或普通PCR仪上，经65℃加热5分钟，41℃加热5分钟后，再加入5μl 5×酶混合液，轻弹混匀，再次短暂离心；

(4)上机检测：将预处理的反应管放入荧光定量PCR仪上进行RNA等温扩增和熔解曲线检测。RNA等温扩增条件：41℃反应30-60分钟；熔解曲线检测条件：按照0.14℃/step升温速率，从40℃到75℃逐渐升高温度，熔解曲线分析程序记录每一次升温分子信标产生的荧光值。Melting analysis程序在荧光定量PCR仪(LightCycler 480型，Roche公司)上进行。

(5)结果判定：根据检测样本的熔解曲线Tm值判断结果。首先是质控系统判断，即阴性对照和空白对照均无熔解峰，否则系统检测无效。当系统检测有效时，判断待测样本结果，不同菌对应不同熔解Tm值(如图1所示)。

(6)注意事项：实验全过程都应使用无粉手套。为了避免实验中的交叉污染，在加模板的过程中，应首先加空白对照和阴性对照，其次加待测样本，最后加阳性对照。实施例4：临床常见致病细菌RNA恒温扩增熔解曲线法检测试剂盒的灵敏度分析

1、方法：

(1)样本处理：取临床鉴定为屎肠球菌的样本，收集菌，用生理盐水调菌浓度至1.5×10⁸CFU/ml，然后按100μl菌液+900μl生理盐水的方式，将其依次做10倍梯度稀释，12000rpm离心30s，弃700μl上清，然后加入100mg 100nm玻璃珠，震荡仪上2000转破碎5min，取上清约300μl至96深孔板中，核酸提取仪上提取RNA。以1.5×10⁷至1.5×10²CFU/ml菌液提取RNA作为模板，每个浓度梯度各取6μl用于扩增。

(2)RNA恒温扩增检测：采用实施例三所述检测方法进行试剂配制，各梯度稀释模板5μl，然后将反应管置于普通PCR仪上(MJ PCR仪)上于65℃加热5分钟，41℃加热5分钟后，将反应管短暂离心，加入5ul酶混合液，轻弹混匀，再次短暂离心，接着将反应管置于荧光PCR仪(Roche LightCycler 480型荧光PCR仪)上进行等温扩增和熔解曲线检测，设置反应条件为：41℃加热30min，荧光检测通道选择CY5，熔解曲线检测时间约为10分钟。反应完成后观察熔解曲线熔解峰Tm值，分析本发明所述试剂盒所能检测到的模板浓度最低限。

(3)结果：本发明所述临床常见致病细菌RNA恒温扩增熔解曲线检测试剂盒只需60分钟左右时间可检测到浓度为1.5×10³CFU/ml菌液提取的RNA，结果见图2。本发明所述临床常见致病细菌RAN恒温扩增熔解曲线法检测试剂盒快速、高效，灵敏度高，能在微生物菌株快速鉴定中发挥重要作用。

实施例5：临床常见致病细菌恒温扩增检测试剂盒对临床样品的检测

1、样本：从浙江邵逸夫医院取20份疑似细菌感染的尿液进行检测。

2、方法：用核酸提取仪提取标本的细菌RNA，然后采用本发明的恒温扩增检测试剂盒进行检测，并与医院培养鉴定结果对比符合率。

3、检测步骤：

(1)细菌RNA提取，取1ml尿液标本于1.5ml离心管中，12000rpm离心5min，弃700μl上清，在沉淀中加入100mg玻璃珠，研磨仪上2000转破碎5min，取上清约300μl至96深孔板裂解孔中，采用磁珠在核酸提取仪上提取；

(2)RNA恒温扩增和熔解曲线检测：按实施例三的方法进行操作。

4、检测结果：利用本发明提供的RNA恒温扩增熔解曲线法检测试剂盒共检出9株阳性细菌样本，检出率为45％，与医院培养鉴定结果完全一致，两种方法的符合率为100％，结果见表1。

表1 20份临床细菌感染尿液样本检测结果

本发明可应用于临床微生物菌株的快速鉴定。

SEQUENCE LISTING

<110> 温州迪安医学检验所有限公司

<120> 一种RNA恒温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用

<130> SG20170223001

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物F1

<400> 1

gaagagtttg atcatggctc ag 22

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<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物R1

<400> 2

aattctaata cgactcacta tagggagaag gttactcacc cgtccgccac t 51

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物F2

<400> 3

gcaacgcgaa gaaccttacc 20

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物R2

<400> 4

aattctaata cgactcacta tagggagaag gacgacagcc atgcagcacc t 51

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 分子信标探针P1

<400> 5

gcgcggccta atacatgcaa gtcgagcgaa cggacgggga gcttgcccgc gc 52

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 分子信标探针P2

<400> 6

gcccgttaga gatagaggct tcaccttcgg aggacaatgt gaacgggc 48

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 分子信标探针P3

<400> 7

cgcgcgggcc gaacacaaaa agttaagctt cttagcgccg attgtagccg cgcg 54