禾谷镰孢的特异性PCR扩增引物及检测体系与应用的制作方法

文档序号:12697922阅读:来源:国知局

技术特征:

1.禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的特异性PCR扩增引物,其特征在于,包括:

正向引物Fg18TF:5’-TTGTAAGTGTTTTCCTCTGACCT-3’

反向引物Fg18TR:5’-AGAAAGCAGCACCGATTTGG-3’;以及

正向巢式外引物HW18TF:5’-AACATGCGTGAGATTGTAAGTG TT-3’

反向巢式外引物HW18TR:5’-TAAACACCATTGCTGTCGAGA-3’。

2.含有权利要求1所述引物的用于检测禾谷镰孢的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。

4.权利要求1所述引物或权利要求2或3所述试剂盒在检测禾谷镰孢中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,包括以下步骤:

1)提取样品中的DNA;

2)以步骤1)中提取的DNA为模板,利用引物Fg18TF和Fg18TR进行单轮PCR扩增反应;或者,

当模板DNA浓度过低导致无法扩增出条带时,采用巢式PCR;先利用巢式外引物HW18TF和HW18TR进行第一轮PCR扩增反应,然后取1~2μL扩增产物作为模板,利用引物Fg18TF和Fg18TR进行第二轮PCR扩增反应;

3)分析PCR扩增产物。

6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,PCR反应体系为:1U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL,10×PCR反应缓冲液1.0μL,2.5mM dNTPs 0.5μL,10μmol/L正向、反向引物各0.5μL,DNA模板1.0μL,ddH2O 6.25μL。

7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,进行单轮PCR扩增反应以及巢式PCR中第二轮PCR扩增反应,所采用的反应程序为:94℃5min;95℃50s,58℃50s,72℃1min,35个循环;72℃10min;

巢式PCR中第一轮PCR扩增反应,所采用的反应程序为:94℃5min;95℃50s,56℃50s,72℃1min,35个循环;72℃10min。

8.根据权利要求5-7任一项所述的应用,其特征在于,对PCR扩增产物进行1~2%琼脂糖凝胶电泳,如果电泳检测结果出现大小为291bp的特征条带,则表明样品中含有禾谷镰孢。

9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述样品为含有禾谷镰孢的菌丝、分生孢子的样品。

10.禾谷镰孢的特异性PCR检测体系,其特征在于,包括:1U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL,10×PCR反应缓冲液1.0μL,2.5mM dNTPs 0.5μL,10μmol/L正向、反向引物各0.5μL,DNA模板1.0μL,ddH2O 6.25μL;

其中,正向、反向引物的定义同权利要求1所述。

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