本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测ADAMTS13基因全外显子突变的试剂盒和方法。
背景技术：
1924年，Eli Moschcowitz最初详述了血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenicpurpura，TTP)，其在临床上主要表现为典型的三联征:即血小板减少，微血管病性溶血性贫血，神经系统损伤；若同时伴有肾脏损害及发热，则形成TTP经典的“五联征”。1997年，慢性复发性TTP患者缓解期血浆中的超大分子量vWF多聚体与vWF裂解酶的缺失之间的联系正式确立。此后，研究者们将这种水解蛋白酶纯化，对先天性TTP家族成员进行了全基因组连锁分析。ADAMTS13基因位于9q34，长度为37kb，包含29个外显子。Zheng等首次对ADAMTS13进行了克隆，并将其列为ADAMTS家族的新成员，称为ADAMTS13。先天性TTP的发病率小于5％，由于严重的ADAMTS13缺乏所致，与ADAMTS13基因突变有关。
现已报道的ADAMTS13突变已经超过140种，包括错义突变、小片段缺失和插入、无义突变以及结合点突变等等。ADAMTS13的基因突变波及整个ADAMTS13蛋白，主要是降低其分泌和(或)酶活性。获得性TTP80％的TTP患者属于获得性TTP，通常由于循环ADAMTS13自身抗体所致。这些抗体能够抑制ADAMTS13蛋白的活性，但是也有10％－15％的患者体内没有抑制性抗体，而是由于增加了抗体调节的ADAMTS13清除率导致ADAMTS13活性严重减低所致。
直接突变检测通过DNA测序仪对ADAMTS13基因直接测序，找出突变的确切位置，可提供更为准确的信息。由于实现了自动化操作，我们采用的PCR结合DNA直接测序方法，因而大大缩短了诊断时间，节省了的人力和物力，测序效率高，能够确定基因突变的位置和形式，结果也更为明确。
多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等方法,但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。目前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于ADAMTS13容量大、突变类型多、突变位点散在分布,故而阻止了对ADAMTS13基因突变的深入研究，荧光定量PCR法并不适用。
本发明采用Sanger测序法检测ADAMTS13基因全外显子序列的突变，并且设计的引物可以扩展全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解ADAMTS13基因全外显子的基因突变情况，并不受ADAMTS13的基因突变多样化以及没有突变热点的影响，并且很大程度的节省了检测成本。
技术实现要素：
本发明提供检测ADAMTS13基因全外显子的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测ADAMTS13基因全外显子突变的情况，用于TTP的基因诊断。
本发明的目的在于提供检测ADAMTS13基因全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测ADAMTS13基因全外显子突变的26对正、反向引物；其碱基序列为：
进一步地，引物序列ADAMTS13-1F、ADAMTS13-1R是扩增ADAMTS13基因第1号外显子序列的引物，引物序列ADAMTS13-2F、ADAMTS13-3R是扩增ADAMTS13基因第2号外显子序列的引物，引物序列ADAMTS13-5-6F、ADAMTS13-5-6R是扩增ADAMTS13基因第5和6号外显子序列的引物，以此类推，引物序列ADAMTS13-17-18F、ADAMTS13-17-18R是扩增ADAMTS13基因第17和18号外显子序列的引物，引物序列ADAMTS13-29F、ADAMTS13-29R是扩增ADAMTS13基因第29号外显子序列的引物。
进一步地，所述26对正、反向引物的使用浓度为1:1；
本发明的目的还在于提供一种检测ADAMTS13基因全外显子的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用26对扩增引物ADAMTS13-1F与ADAMTS13-1R；ADAMTS13-2F与ADAMTS13-2R；ADAMTS13-3F与ADAMTS13-3R；ADAMTS13-4F与ADAMTS13-4R；ADAMTS13-5-6F与ADAMTS13-5-6R；ADAMTS13-7F与ADAMTS13-7R；ADAMTS13-8F与ADAMTS13-8R；ADAMTS13-9F与ADAMTS13-9R；ADAMTS13-10-11F与ADAMTS13-10-11R；ADAMTS13-12F与ADAMTS13-12R；ADAMTS13-13F与ADAMTS13-13R；ADAMTS13-14F与ADAMTS13-14R；ADAMTS13-15F与ADAMTS13-15R；ADAMTS13-16F与ADAMTS13-16R；ADAMTS13-17-18F与ADAMTS13-17-18R；ADAMTS13-19F与ADAMTS13-19R；ADAMTS13-20F与ADAMTS13-20R；ADAMTS13-21F与ADAMTS13-21R；ADAMTS13-22F与ADAMTS13-22R；ADAMTS13-23F与ADAMTS13-23R；ADAMTS13-24F与ADAMTS13-24R；ADAMTS13-25F与ADAMTS13-25R；ADAMTS13-26F与ADAMTS13-26R；ADAMTS13-27F与ADAMTS13-27R；ADAMTS13-28F与ADAMTS13-28R；ADAMTS13-29F与ADAMTS13-29R对(1)中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测ADAMTS13基因全外显子的扩增产物；
(3)利用1对测序引物M13-F与M13-R对(2)中的扩增产物进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与野生型ADAMTS13基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其中所述引物序列为：
本发明的目的还在于提供一种检测ADAMTS13基因全外显子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括26对扩增引物ADAMTS13-1F与ADAMTS13-1R；ADAMTS13-2F与ADAMTS13-2R；ADAMTS13-3F与ADAMTS13-3R；ADAMTS13-4F与ADAMTS13-4R；ADAMTS13-5-6F与ADAMTS13-5-6R；ADAMTS13-7F与ADAMTS13-7R；ADAMTS13-8F与ADAMTS13-8R；ADAMTS13-9F与ADAMTS13-9R；ADAMTS13-10-11F与ADAMTS13-10-11R；ADAMTS13-12F与ADAMTS13-12R；ADAMTS13-13F与ADAMTS13-13R；ADAMTS13-14F与ADAMTS13-14R；ADAMTS13-15F与ADAMTS13-15R；ADAMTS13-16F与ADAMTS13-16R；ADAMTS13-17-18F与ADAMTS13-17-18R；ADAMTS13-19F与ADAMTS13-19R；ADAMTS13-20F与ADAMTS13-20R；ADAMTS13-21F与ADAMTS13-21R；ADAMTS13-22F与ADAMTS13-22R；ADAMTS13-23F与ADAMTS13-23R；ADAMTS13-24F与ADAMTS13-24R；ADAMTS13-25F与ADAMTS13-25R；ADAMTS13-26F与ADAMTS13-26R；ADAMTS13-27F与ADAMTS13-27R；ADAMTS13-28F与ADAMTS13-28R；ADAMTS13-29F与ADAMTS13-29R，测序体系反应液包括1对测序引物M13-F与M13-R。
进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer；dNTPs；KOD FX DNA Polymerase。
进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
有益效果：本发明设计了扩增覆盖检测ADAMTS13基因全外显子序列的26对正、反向引物，并在PCR扩增的上游引物5’端和下游引物5’端分别加了一段长18bp的M13-F引物序列和长16bp的M13-R引物序列。这样扩增产物两端都会带上所引入的M13-F及M13-R引物序列，随后进行测序反应的时候，所有的扩增产物可以使用统一的M13-F和M13-R引物进行正反向测序。因为ADAMTS13基因有29个外显子，每个样本检测需要扩增26个PCR产物，如果每个产物使用各自的测序引物进行测序，操作将会十分繁琐，也极易引起污染。而本试剂盒这样的设计有效的避免了这一问题，大大简化了测序反应的操作步骤，使整个过程非常便捷。同时通过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。
利用本发明所述扩展引物和测序引物，可以扩展整个全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解ADAMTS13基因全外显子的基因突变情况，并不受ADAMTS13突变多样化以及没有突变热点的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测ADAMTS13基因全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测ADAMTS13基因全外显子的26对正、反向引物；所述扩展引物的碱基序列为：
所述引物还包括1对测序引物，其碱基序列为
M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R：AACAGCTATGACCATG
在检测中，先利用上述26对正、反向扩增引物对覆盖检测ADAMTS13基因全外显子的DNA片段进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述1对测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的基因序列。
在引物设计上，所设计的每对引物都位于所要扩增的外显子序列两侧，即扩增区域包括了该外显子的全部序列。因为ADAMTS13的突变位点很多，突变类型不定。因此本发明所述引物既能将所述全部外显子序列都扩增出来，也保证无论外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。因为第5和6号外显子、第10和11号外显子、第17和18号外显子序列都较短，中间的内含子序列也很短，因此本发明在检测第5和6号外显子、10和11号外显子、17和18号外显子时，分别采用一对扩增引物，为ADAMTS13-5-6F和ADAMTS13-5-6R、ADAMTS13-10-11F和ADAMTS13-10-11R、ADAMTS13-17-18F和ADAMTS13-17-18F。通过如上创新性的用一对引物检测连续的两个外显子，减少了实验的操作步骤，缩短了检测时间，减少了人力的投入，同时引物数量的减少，降低了检测成本。
检测ADAMTS13基因全外显子的试剂盒，包括：组织DNA抽提试剂盒(例如使用天根生物的提取试剂盒)、无水乙醇、检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中
检测体系PCR反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；检测目的基因用的26对上、下游引物ADAMTS13-1F(10μm)与ADAMTS13-1R(10μm)；ADAMTS13-2F(10μm)与ADAMTS13-2R(10μm)；ADAMTS13-3F(10μm)与ADAMTS13-3R(10μm)；ADAMTS13-4F(10μm)与ADAMTS13-4R(10μm)；ADAMTS13-5-6F(10μm)与ADAMTS13-5-6R(10μm)；ADAMTS13-7F(10μm)与ADAMTS13-7R(10μm)；ADAMTS13-8F(10μm)与ADAMTS13-8R(10μm)；ADAMTS13-9F(10μm)与ADAMTS13-9R(10μm)；ADAMTS13-10-11F(10μm)与ADAMTS13-10-11R(10μm)；ADAMTS13-12F(10μm)与ADAMTS13-12R(10μm)；ADAMTS13-13F(10μm)与ADAMTS13-13R(10μm)；ADAMTS13-14F(10μm)与ADAMTS13-14R(10μm)；ADAMTS13-15F(10μm)与ADAMTS13-15R(10μm)；ADAMTS13-16F(10μm)与ADAMTS13-16R(10μm)；ADAMTS13-17-18F(10μm)与ADAMTS13-17-18R(10μm)；ADAMTS13-19F(10μm)与ADAMTS13-19R(10μm)；ADAMTS13-20F(10μm)与ADAMTS13-20R(10μm)；ADAMTS13-21F(10μm)与ADAMTS13-21R(10μm)；ADAMTS13-22F(10μm)与ADAMTS13-22R(10μm)；ADAMTS13-23F(10μm)与ADAMTS13-23R(10μm)；ADAMTS13-24F(10μm)与ADAMTS13-24R(10μm)；ADAMTS13-25F(10μm)与ADAMTS13-25R(10μm)；ADAMTS13-26F(10μm)与ADAMTS13-26R(10μm)；ADAMTS13-27F(10μm)与ADAMTS13-27R(10μm)；ADAMTS13-28F(10μm)与ADAMTS13-28R(10μm)；ADAMTS13-29F(10μm)与ADAMTS13-29R(10μm)。
测序体系反应液包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：M13-F(3.2μm)与M13-R(3.2μm)，以及Bigdye TeRminatoR V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。
阳性对照品：含有野生型ADAMTS13序列的溶液。
阴性对照品：无野生型ADAMTS13序列的溶液。
空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。
实施例2
(1)抽提血液中的基因组DNA(按照血液DNA抽提试剂盒(天根生物)的说明书操作):
1)抽取500ul血液加入1000ul红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000Rpm离心5分钟，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200ul缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，短暂离心以去除管盖内壁的水珠。
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，短暂离心以去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000Rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000Rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000Rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000Rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000Rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000Rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
检测体系PCR反应液配制如下：
其中，F与R选自ADAMTS13-1F与ADAMTS13-1R；ADAMTS13-2F与ADAMTS13-2R；ADAMTS13-3F与ADAMTS13-3R；ADAMTS13-4F与ADAMTS13-4R；ADAMTS13-5-6F与ADAMTS13-5-6R；ADAMTS13-7F与ADAMTS13-7R；ADAMTS13-8F与ADAMTS13-8R；ADAMTS13-9F与ADAMTS13-9R；ADAMTS13-10-11F与ADAMTS13-10-11R；ADAMTS13-12F与ADAMTS13-12R；ADAMTS13-13F与ADAMTS13-13R；ADAMTS13-14F与ADAMTS13-14R；ADAMTS13-15F与ADAMTS13-15R；ADAMTS13-16F与ADAMTS13-16R；ADAMTS13-17-18F与ADAMTS13-17-18R；ADAMTS13-19F与ADAMTS13-19R；ADAMTS13-20F与ADAMTS13-20R；ADAMTS13-21F与ADAMTS13-21R；ADAMTS13-22F与ADAMTS13-22R；ADAMTS13-23F与ADAMTS13-23R；ADAMTS13-24F与ADAMTS13-24R；ADAMTS13-25F与ADAMTS13-25R；ADAMTS13-26F与ADAMTS13-26R；ADAMTS13-27F与ADAMTS13-27R；ADAMTS13-28F与ADAMTS13-28R；ADAMTS13-29F与ADAMTS13-29R。
(3)加样：加入3个检测体系PCR反应液中各2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。其中阳性对照品是含有野生型ADAMTS13序列的溶液，阴性对照品是无野生型ADAMTS13序列的溶液，空白对照品是2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veRiti(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件如下：
(5)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与测序引物：M13-F(3.2μm)与M13-R(3.2μm)，按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700Rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml 70％乙醇，漩涡混匀；3700Rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性程序：
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：将测序结果与野生型参考序列(GeneBank No.:NG_011934.2)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取临床患者样本8份，8份样本都确定是患有TTP，检测该8份样本是否存在ADAMTS13突变。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品2μl加入检测体系PCR反应液中。同时做阳性对照，阴性对照，空白对照各一份。检测结果如下所述：
阳性对照品的测序结果与野生型ADAMTS13序列(GeneBank No.:NG_011934.2)进行对比，发现两者完全一致，证明所用引物可以准确扩增出ADAMTS13基因的全部外显子，使用其引物进行扩增和测序的方法准确可靠，符合基因扩增和测序要求。
阴性对照品和空白对照品未出现测序结果，说明上述引物不会产生非特异性扩增，测序结果真实可靠。
8份临床患者样本中，根据其测序结果与野生型ADAMTS13序列(GeneBank No.:NG_011934.2)进行对比，未发现突变，说明8份样本不存在ADAMTS13突变。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 检测ADAMTS13基因全外显子的试剂盒和方法
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<170> PatentIn version 3.5
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aacagctatg accatgcaga agggtggcga agtggaagag g 41
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgtaaaacga cggccagtag ctccctttgt ctgtggtgtg gtg 43
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aacagctatg accatgcaac tatcaagcct gagggtggtt 40
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgtaaaacga cggccagttg gggaccccgg gaaggagagt cac 43
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
aacagctatg accatgctgt aagtgaccgc tgaatgaata 40
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtaaaacga cggccagttt ggccaggctg gagtgctatg ttg 43
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
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aacagctatg accatgtgca gaatgggggc actcacagag c 41
<210> 31
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tgtaaaacga cggccagttc accagcctgt gattcggttg tcc 43
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
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aacagctatg accatgtaag gaactctgac agcagcactt a 41
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtaaaacga cggccagttc ctctttgggc tcctggatgt tgg 43
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<213> 人工序列
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aacagctatg accatgggca atgggtgctc ctcgttctcc 40
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtaaaacga cggccagtgc aaggataccc gctgcgagac cg 42
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<213> 人工序列
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aacagctatg accatgtcag ccaatcaaca cccacatttg a 41
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tgtaaaacga cggccagtac ccatgcgggc cttatgtgct aga 43
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tgtaaaacga cggccagtaa gggggcctcc agaaagagaa cct 43
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<212> DNA
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aacagctatg accatgctgt gttgcccagg ttggacttgc a 41
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<213> 人工序列
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tgtaaaacga cggccagtgg gctcagtggc tgcactttcc at 42
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aacagctatg accatgcttc cagcgtcccc aaacctaagg 40
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtaaaacga cggccagtgt gtgtccttgg ggaagtgatg taa 43
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<400> 54
aacagctatg accatg 16