一种用于检测C‑kit基因K642E突变位点的引物、探针及试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测C-kit基因K642E突变位点的引物、探针及试剂盒。

背景技术：

C-kit原癌基因位于4号染色体长臂，基因全长约80kb，由21个外显子组成。C-kit的mRNA长5185bp，其开放式阅读框长2931bp，编码976个氨基酸残基的跨膜蛋白分子，即跨膜酪氨酸激酶受体C-kit蛋白。KIT蛋白分子量为145kD左右，是Ⅲ型酪氨酸激酶跨膜受体家族成员，由含五个Ig样基序的胞外区(结合配基，1-519位氨基酸)、较短的跨膜区(传导信号，520-543位氨基酸)和含酪氨酸激酶活性的胞浆区(544-976位氨基酸)组成。

C-kit基因异常在肢端和粘膜部位黑素瘤中最常见。这些特点为黑素瘤个体化治疗奠定了理论基础。高加索人种黑素瘤中BRAFV600E突变率最高，最近开发的多种针对突变的向药物，在部分临床试验中己经取得了令人鼓舞的疗效。而亚洲人种与高加索人种不同，其最主要的黑素瘤类型是肢端黑素瘤，这一类型黑素瘤最显著的异常基因是C-kit基因，其中与C-kit基因相关的传导路径SCF/C-kit途径是指当与其配体干细胞生长因子(SCF)结合后，引起C-kit同源二聚体化及胞装区的酪氨酸激酶活化，使得特定酪氨酸发生自酸化，通过PI3K-AKT途径活化，从而来调控细胞生长、增殖、凋亡、迁移及粘附。目前认为SCF/C-kit途径在人类恶性肿瘤中的作用机制主要包括以下两个方面：1.C-kit基因异常导致不依赖SCF配体的C-kit受体活化；2.SCF的自分泌和旁分泌途径对C-kit受体的异常刺激。

现己在胃肠间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor,GIST)、白血病、神经母细胞瘤等多种肿瘤发生过程中发现存在C-kit的持续活化，并且酷氨酸激酶抑制剂-甲酸伊马替尼也己成功运用于GIST的临床治疗中。已经明确大部分GIST的kit基因蛋白可获得性功能突变表达蛋白CD117，从基因方面上，大部分的GIST均存在C-kit基因的活化突变，并保持独立性传导激活。即C-kit蛋白可以在无任何配体相结合的情况下保持持续性的激活自身酪氨酸激酶，从而导致人肥大细胞增生，最终形成人肥大细胞增生病和GIST的发生。随着人们对GIST基因突变研究的不断深入，C-kit基因突变直接涉及到GIST的发生、发展，因此，C-kit基因突变已经成为GIST发生的主要机制。对于病变局限、可手术切除的GIST，仍首选外科手术R0切除。对于术后复发、转移，无法完全切除的患者，分子靶向药物甲磺酸伊马替尼的应用为其提供了全新的治疗方案。GIST中C-kit基因突变率约为80％-90％，突变形式多样，包括替换、缺失和插入重复等。其中位于外显子11Lys550-Va1560区段的突变最为常见(约70％-80％)，位于外显子9Ala502-Tyr503区段的6碱基插入重复突变约占5-10％。

目前，检测C-kit基因突变的主要方法有DNA直接测序法、高分辨率溶解曲线法、ARMS-PCR法。然而，直接测序法灵敏度低，检测灵敏度只有20％-30％，低灵敏度的检测会导致漏检及假阴性的发生。此外，直接测序法实验操作复杂，检测效率低、样品易污染、检测时间长，无法满足临床检测的实际需求。高分辨率溶解曲线法所使用的仪器较特殊，难以在医院普及。

较为先进的C-kit基因突变检测技术是采用扩增突变阻滞系统(Amplification Regractory Mutation System,ARMS)衍生的系列技术。ARMS-PCR是一种在PCR基础上发展起来用于检测DNA中各种点突变的新方法，其依据的基本原理是:Taq DNA聚合酶缺少3′→5′外切酶活性，因此对于3′末端错配的引物，以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，3′末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸，反应终止，也就得不到特异长度的扩增条带，从而表明模板DNA没有与引物3′末端相应的突变；如果PCR结果能得到特异长度的扩增条带，表明模板DNA上具有与引物3′末端相应的突变。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关(Ayyadevara S,Thaden JJ,Shmookler Reis RJ,Anal Biochem 2000；284:11-18),还与样本中存在的等位基因变量的影响。为了增加ARMS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证明，该方法最关键的是设计与3’末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克服，如报道的在3’倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准，会出现混乱的情况，见[J Virol Methods.2008 Nov；153(2):156-62；Genomics.2004Feb；83(2):311-320]。简单的ARMS-PCR通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应条件来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了PCR污染的机会，而且耗时费力。尽管有人对该方法做了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是“全或无”式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩增，只是其得到的Ct(Cycle threshold)不同而已，因此就引入了△Ct的概念，即△Ct＝野生Ct-突变Ct，并为△Ct值设定一个阈值，如要△Ct值大于阈值判为突变型纯合子，△Ct值小于阈值判为杂合子，△Ct值为负数，则判为野生型纯合子，△Ct值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为△Ct值的设定标准无法准确定位，不同的标本和不同的检测仪器都会有不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用也很受限。

目前，全球只有许多家企业拥有ARMS相关衍生技术和产品：如Scorpins-ARMS是英国Dxs公司开发的试剂盒，检测灵敏度高，性能稳定。该试剂盒采用探针为Scorpion探针，Scorpion探针是一种新型的探针，由一条发夹结构的探针和一条引物构成，探针的5’端和3’端分别有报告荧光和淬灭荧光，3’端通过PCR blocker(一个非扩增的单体，防止探针退火后的延伸)与引物的5’端相连。在自由状态，报告荧光和淬灭荧光很接近，不产生荧光。变性阶段茎环结构打开，退火时引物与模版结合并延伸，环区与新合成的目的基因的互补区域结合，此时Scorpion探针与PCR产物在同一条DNA链上，是分子内的结合。由于发夹结构打开，报告荧光和淬灭荧光分离，因此可检测到报告荧光发出的荧光信号。由于Scorpion探针中序列特异性引物和探针在同一分子上，因此信号的产生特别快。但是该试剂合成本太高，每份标准需要3000-5000元，不适合广泛推广使用。国内厦门艾德生物医药有限公司属于生产ARMS基因检测试剂盒的行业巨头，但没有C-kit基因K642E突变检测试剂盒。北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司开发是C-kit基因突变检测试剂盒采用的是ARMS结合测序法，此法存在灵敏度低，易污染等弊端。

因此，在临床上迫切需要开发一种高灵敏度，快速的C-kit基因K642E突变检测技术，以实现采用高灵敏度检测方法对C-kit基因K642E突变进行检测，从而为临床肿瘤的个体化治疗方案提供科学参考。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于检测C-kit基因K642E突变位点的引物、探针及试剂盒，用以解决现有针对C-kit基因突变检测周期长，操作过程繁琐，结果判读复杂，灵敏度低，易污染的问题。

为实现上述目的，本发明方法通过以下技术方案予以实现：

一种用于检测C-kit基因K642E突变位点的引物和探针，其特征在于包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针、用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针；

所述用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针选自序列表中SEQ ID NO.01～SEQ ID NO.05所示的任一条；

所述用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针选自序列表中SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.15所示的任一条；

所述质控探针如序列表中SEQ ID NO.18所示；

所述用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭报告基团；

所述质控探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭报告基团。

SEQ ID NO.01～SEQ ID NO.05的序列如下：

SEQ ID NO.01：5’CAGGG AAAACCCTGGGT 3’

SEQ ID NO.02：5’G AAAACCCTGGGT 3’

SEQ ID NO.03：5’AGGG AAAACCCTGGGT 3’

SEQ ID NO.04：5’CAGGG AAAACCCTG 3’

SEQ ID NO.05：5’CAGGG AAAACCC 3’

SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.15的序列如下：

SEQ ID NO.12：5’AGGCTCCAAGTAGATTCACAAT 3’

SEQ ID NO.13：5’ACGGCTTTACCTCCAATGGTGC 3’

SEQ ID NO.14：5’AAGGCAGCTTGGACACGGCTTT 3’

SEQ ID NO.15：5’ATGTTTTGATAACCTGACAGAC 3’

SEQ ID NO.18的序列如下：

SEQ ID NO.18：5’TGTTGCCATCAATGACCCCTTC 3’

优选地，所述用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针5’端连接有H₂N-基团，3’端连接有-CON₂H基团。

经修饰的SEQ ID NO.01～SEQ ID NO.05(用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针)的序列如下：

5’H₂N/CAGGGAAAACCCTGGGT/CON₂H 3’(经修饰的SEQ ID NO.01)

5’H₂N/G AAAACCCTGGGT/CON₂H 3’(经修饰的SEQ ID NO.02)

5’H₂N/AGGG AAAACCCTGGGT/CON₂H 3’(经修饰的SEQ ID NO.03)

5’H₂N/CAGGG AAAACCCTG/CON₂H 3’(经修饰的SEQ ID NO.04)

5’H₂N/CAGGG AAAACCC/CON₂H 3’(经修饰的SEQ ID NO.05)

优选地，所述用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针5’端连接的荧光报告基团为FAM基团，3’端连接的淬灭报告基团为MGB基团。

优选地，所述质控探针5’端连接的荧光报告基团为HEX基团，3’端连接的淬灭报告基团为MGB基团。

经荧光报告基团和淬灭报告基团标记的SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.15(用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针)的序列如下：

5’FAM/AGGCTCCAAGTAGATTCACAAT/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.12)

5’FAM/ACGGCTTTACCTCCAATGGTGC/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.13)

5’FAM/AAGGCAGCTTGGACACGGCTTT/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.14)

5’FAM/ATGTTTTGATAACCTGACAGAC/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.15)

经荧光报告基团和淬灭报告基团标记的SEQ ID NO.18(质控探针)的序列如下：

5’HEX/TGTTGCCATCAATGACCCCTTC/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.18)

优选地，所述用于特异性扩增靶向序列的上游引物选自序列表中SEQ ID NO.06～SEQ ID NO.08所示的任一条；

SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.8的序列如下：

SEQ ID NO.06：5’ATTAAGTCAGATGCGGCC 3’

SEQ ID NO.07：5’CTGCTTA TGGCTTAATT A 3’

SEQ ID NO.08：5’CTGCTTA TGGCTTAATT A3’

所述用于特异性扩增靶向序列的下游引物选自序列表中SEQ ID NO.09～SEQ ID NO.11所示的任一条。

SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.11的序列如下：

SEQ ID NO.09：5’TGACAGACAATAAAAGGCAGCT 3’

SEQ ID NO.10：5’AGCTTGGACACGGCTTTACCTC 3’

SEQ ID NO.11：5’CCTCCAATGGTGCAGGCTCC 3’

优选地，所述质控引物对的上游引物选自序列表中的SEQ ID NO.16，下游引物选自序列表中的SEQ ID NO.17。

SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的序列如下：

SEQ ID NO.16：5’CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG 3’

SEQ ID NO.17：5’CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT 3’

本发明的原理是：应用肽核酸PNA探针阻断C-kit野生型基因扩增，设计特异性引物及MGB探针与突变模版稳固结合，选用热启动DNA聚合酶，以脱氧核苷酸为底物，进行C-kit突变基因的体外PCR扩增。MGB探针在PCR过程中水解释放荧光信号对整个扩增过程进行实时监测，从而确定待测样本的C-kit基因K642E突变情况。

本发明还提供一种用于检测C-kit基因K642E突变位点的试剂盒，其包含上述引物和探针。

优选地，所述的试剂盒包含定量反应体系试剂和检测反应体系试剂，所述定量反应体系试剂包含用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针；所述检测反应体系试剂包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针、用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针。

优选地，所述的试剂盒中的引物的浓度为0.1～1.0μmol，探针的浓度为0.1～1.0μmol。

优选地，所述的试剂盒，还包括PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和模版DNA。

本发明经过大量实验、研究和分析成功研究出能够用于快速、灵敏、有效的检测C-kit基因K642E突变的试剂盒。利用这个试剂盒可以检测出人类C-kit基因K642E突变情况。

本发明涉及的人类C-kit基因K642E突变检测试剂盒，与现有技术相比，本发明在PNA探针区分野生型和突变型基因的基础上，建立了多重实时PCR检测人类C-kit基因K642E位点突变的试剂盒，该试剂盒具有以下有益效果和显著进步：

本发明方法具有如下优点：本发明设计的C-kit基因K642E突变位点检测试剂盒适用于临床多种样本类型选择，具有特异性强，灵敏度高，实验周期短，操作简单，安全无毒成本低等显著优点。

附图说明

图1是实施例6检测阴性样本PCR图。

图2是实施例6检测突变阳性样本PCR图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1一种用于检测C-kit基因K642E突变位点的试剂盒

所述的试剂盒包含定量反应体系试剂和检测反应体系试剂、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和模版DNA。

所述定量反应体系试剂包含用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针；所述检测反应体系试剂包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针、用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针。

所述检测反应体系试剂包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针的序列为：5’H₂N/CAGGGAAAACCCTGGGT/CON₂H 3’(经修饰的SEQ ID NO.01)

所述用于特异性扩增靶向序列的上游引物的序列为：5’ATTAAGTCAGATGCGGCC 3’(SEQ ID NO.06)

所述的用于特异性扩增靶向序列的下游引物的序列为：5’TGACAGACAATAAAAGGCAGCT 3’(SEQ ID NO.09)

用于检测c-kit基因K642E突变位点的探针的序列为：5’FAM/AGGCTCCAAGTAGATTCACAAT/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.12)

质控引物对的序列为：

5’CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG 3’(SEQ ID NO.16)

5’CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT 3’(SEQ ID NO.17)

质控探针的序列为：5’HEX/TGTTGCCATCAATGACCCCTTC/MGB3’(经标记的SEQ ID NO.18)

试剂盒中引物的浓度为0.5μmol，探针的浓度0.5μmol，dNTPs的浓度为0.5mmol，MgCl2的浓度为3.5mmol，TaqDNA聚合酶为1～2Unit和模版DNA为30.0μl。

实施例2

所述的试剂盒包含定量反应体系试剂和检测反应体系试剂、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和模版DNA。

所述定量反应体系试剂包含用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针；所述检测反应体系试剂包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针、用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针。

所述检测反应体系试剂包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针的序列为：5’H₂N/G AAAACCCTGGGT/CON₂H 3’(经修饰的SEQ ID NO.02)

所述用于特异性扩增靶向序列的上游引物的序列为：5’CTGCTTA TGGCTTAATT A3’(SEQ ID NO.07)

所述的用于特异性扩增靶向序列的下游引物的序列为：5’AGCTTGGACACGGCTTTACCTC 3’(SEQ ID NO.10)

用于检测c-kit基因K642E突变位点的探针的序列为：5’FAM/ACGGCTTTACCTCCAATGGTGC/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.13)

质控引物对的序列为：

5’CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG 3’(SEQ ID NO.16)

5’CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT 3’(SEQ ID NO.17)

质控探针的序列为：5’HEX/TGTTGCCATCAATGACCCCTTC/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.18)

试剂盒中引物的浓度为0.5μmol，探针的浓度0.5μmol，dNTPs的浓度为0.5mmol，MgCl2的浓度为3.5mmol，TaqDNA聚合酶为1～2Unit和模版DNA为30.0μl。

实施例3

所述的试剂盒包含定量反应体系试剂和检测反应体系试剂、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和模版DNA。

所述定量反应体系试剂包含用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针；所述检测反应体系试剂包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针、用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针。

所述检测反应体系试剂包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针的序列为：5’H₂N/AGGG AAAACCCTGGGT/CON₂H 3’(经修饰的SEQ ID NO.03)

所述用于特异性扩增靶向序列的上游引物的序列为：5’CTGCTTA TGGCTTAATT A3’(SEQ ID NO.08)

所述的用于特异性扩增靶向序列的下游引物的序列为：5’CCTCCAATGGTGCAGGCTCC 3’(SEQ ID NO.11)

用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针的序列为：5’FAM/AAGGCAGCTTGGACACGGCTTT/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.14)

质控引物对的序列为：

5’CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG 3’(SEQ ID NO.16)

5’CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT 3’(SEQ ID NO.17)

质控探针的序列为：5’HEX/TGTTGCCATCAATGACCCCTTC/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.18)

试剂盒中引物的浓度为0.5μmol，探针的浓度0.5μmol，dNTPs的浓度为0.5mmol，MgCl2的浓度为3.5mmol，TaqDNA聚合酶为1～2Unit和模版DNA为30.0μl。

实施例4

所述的试剂盒包含定量反应体系试剂和检测反应体系试剂、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和模版DNA。

所述定量反应体系试剂包含用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针；所述检测反应体系试剂包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针、用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针。

所述检测反应体系试剂包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针的序列为：5’H₂N/CAGGG AAAACCCTG/CON₂H 3’(经修饰的SEQ ID NO.04)

所述用于特异性扩增靶向序列的上游引物的序列为：5’CTGCTTA TGGCTTAATT A3’(SEQ ID NO.08)

所述的用于特异性扩增靶向序列的下游引物的序列为：5’CCTCCAATGGTGCAGGCTCC 3’(SEQ ID NO.11)

用于检测c-kit基因K642E突变位点的探针的序列为：5’FAM/ATGTTTTGATAACCTGACAGAC/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.15)

质控引物对的序列为：

5’CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG 3’(SEQ ID NO.16)

5’CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT 3’(SEQ ID NO.17)

质控探针的序列为：5’HEX/TGTTGCCATCAATGACCCCTTC/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.18)

试剂盒中引物的浓度为0.5μmol，探针的浓度0.5μmol，dNTPs的浓度为0.5mmol，MgCl2的浓度为3.5mmol，TaqDNA聚合酶为1～2Unit和模版DNA为30.0μl。

实施例5一种用于检测C-kit基因K642E突变位点的试剂盒

所述的试剂盒包含定量反应体系试剂和检测反应体系试剂、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和模版DNA。

所述定量反应体系试剂包含用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针；所述检测反应体系试剂包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针、用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针。

所述检测反应体系试剂包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针的序列为：5’H₂N/CAGGG AAAACCC/CON₂H 3’(经修饰的SEQ ID NO.05)

所述用于特异性扩增靶向序列的上游引物的序列为：5’ATTAAGTCAGATGCGGCC 3’(SEQ ID NO.06)

所述的用于特异性扩增靶向序列的下游引物的序列为：5’TGACAGACAATAAAAGGCAGCT 3’(SEQ ID NO.09)

用于检测c-kit基因K642E突变位点的探针的序列为：5’FAM/AGGCTCCAAGTAGATTCACAAT/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.12)

质控引物对的序列为：

5’CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG 3’(SEQ ID NO.16)

5’CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT 3’(SEQ ID NO.17)

质控探针的序列为：5’HEX/TGTTGCCATCAATGACCCCTTC/MGB 3’(经标记的SEQ ID NO.18)

试剂盒中引物的浓度为0.5μmol，探针的浓度0.5μmol，dNTPs的浓度为0.5mmol，MgCl₂的浓度为3.5mmol，TaqDNA聚合酶为1～2Unit和模版DNA为30.0μl。

实施例6试剂盒的使用方法

一、临床样本DNA的提取

本实施例是从胃肠道间质瘤患者的石蜡包埋组织中提取DNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模版。提取采用天根石蜡包埋组织DNA提取试剂盒，具体操作方法步骤如下。

(1)样本处理

a.石蜡切片：取石蜡切片(5-10μm厚，1×1cm²大小)5-8张。

b.石蜡块：手术刀刮取约30mg的组织样本(尽量去除多余的石蜡)。

注意：如果样品表面暴露于空气中，最初刮取的2-3片弃掉不用。

c.福尔马林等固定液中的样本：取30mg样本，用手术刀切为数块,置于1.5ml离心管中，加入500μl PBS(10mM，pH值7.4)涡旋振荡混匀,12,000rpm(～13,400×g)室温离心1min，弃上清，重复3次,然后从步骤7开始操作。

(2)将石蜡切片或石蜡块样本装于1.5ml无菌离心管中，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10sec。

(3)12,000rpm(～13,400×g)室温离心2min，弃上清。注意：不要倒掉沉淀。

(4)在上述管中加入1ml无水乙醇，涡旋混匀10sec。

(5)12,000rpm(～13,400×g)室温离心2min，弃上清。注意：不要倒掉沉淀。

(6)室温放置5-10min，充分挥发乙醇。

(7)加入200μl缓冲液GA和20μl Proteinase K，充分混匀，56℃孵育1h直至样本完全裂解。置于90℃孵育1h。

(8)(可选步骤)如果要去除RNA，可以将样品中加入2μl RNase A(100mg/ml)，室温孵2min后，进行下一步操作。

(9)在上管中加入220μl缓冲液GB涡旋混匀，再加入250μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀，短暂离心使管壁上的溶液收集到管底。

(10)将上一步所得的混合液加入一个吸附柱CR2中8,000rpm(～6,000×g)室温离心2min，倒掉废液，重新将吸附柱放回收集管中。注意：吸附柱最大容量为700μl，可将剩余液体重复上述步骤上柱。

(11)向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD，8,000rpm(～6,000×g)室温离心60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

(12)向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW，8,000rpm(～6,000×g)室温离心60sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。

(13)重复操作步骤12。

(14)将吸附柱CR2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱开盖置于室温放置2-5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥太长时间，以免难以洗脱DNA。

(15)将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加65℃预热的30-100μl洗脱缓冲液TE或ddH2O洗脱，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将收集有DNA的离心管-20℃保存。注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CR2中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

(16)定量将提取的DNA用紫外分光光度计进行定量，并稀释DNA浓度到40ng/μl。

二、使用本发明试剂盒采用实时荧光定量PCR法扩增临床样本DNA

采用实施例1所述的C-kit基因K642E位点基因突变检测试剂盒检测临床样本DNA(按步骤一所述的方法提取)，8联PCR反应条偶数孔为检测反应体系扩增突变模版，用来检测待检样本突变情况；8联PCR反应条奇数孔为定量反应体系，用来质控待检样本质量。

表1：试剂盒所提供的引物和探针序列

检测方法如下：

(1)取10μl(40ng/μl)待检测样本加入Taq DNA聚合酶1.2μl，盖紧管盖轻微振荡混匀离心，置于冰上，待用。

(2)取8联PCR反应条，确定奇数偶数孔后轻轻打开管盖。将步骤(1)混匀的待用液分别加到偶数孔检测体系与奇数孔定量体系中，盖紧管盖，离心，确保试剂全落在PCR反应管的管底(注意避免剧烈振荡引起基因组DNA断裂)。

(3)把离心好的8联PCR反应条放置于荧光定量PCR仪中，PCR反应体系为：

(4)设置PCR程序：95℃15min，95℃10s，60℃30s，95℃15s，60℃60s，95℃15s。第三个阶段60℃时收集荧光信号，40个循环。

本发明利用PNA区分野生型和突变型基因序列，通过反应体系的荧光信号强度来判断检测结果；HEX是内控信号，用于检测是否漏加样本及初步判定上样的DNA量是否在允许范围内，HEX信号应达到设定阈值(Ct值大于26)；FAM是检测信号，用于检测是否存在突变位点；在内控信号达到要求后，以FAM信号达到设定阈值所需的循环次数Ct值作为判断标准，首先定量体系Ct值应满足12≤Ct值≤29，若定量体系FAM信号Ct值＜12说明待测样样本DNA上样浓度过大；若Ct值＞29或无Ct值则说明待测样本DNA上样浓度太低或已降解，建议重新处理待测样本DNA再验证。若实验满足以上条件再判定检测样本的突变情况，若检测体系Ct值＜29且△Ct＜10判定检测样本为突变阳性，若检测样本≥29或unde或△Ct≥10判定检测样本无突变为阴性。其中△Ct＝检测体系Ct值-定量体系Ct值。

使用本发明设计的试剂盒检测C-kit基因K642E突变位点时具有如下优点：(1)能有效抑制野生型基因组扩增，只富集突变型基因扩增，大大提高了检测特异性，可有效抑制100ng野生型基因扩增。(2)检出C-kit基因突变基因组DNA敏感度为0.1％，即可检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其他微量组织中突变检测，远远高于测序法。(3)结果判读明确直观，仅需要两个PCR管即可完成对一份样本的检测。结果判读不仅仅依靠Ct值还需要对比两管的Ct差值确定是否突变，增加了结果的准确性。(4)适用于多种样本类型：本技术对样本DNA获取质量要求低，无论是新鲜组织还是石蜡组织，血清，血浆都能获得理想的检测效果。(5)检测时间短，从样本接收到检出结果大约需要3个小时。(6)操作简单，一次加样，从PCR反应开始到结束，一直在封闭的反应体系中进行，不但降低了污染几率，而且降低了结果出现偏差的几率。(7)整个操作过程安全无毒，对操作人员及反应环境均不会造成任何伤害。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 西安医臻生物医药科技有限公司

<120> 一种用于检测C-kit基因K642E突变位点的引物、探针及试剂盒

<130>

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<213> 人工序列

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