一种用于检测K‑RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种用于检测K-RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒。
背景技术：
：K-ras基因是在1964年从大鼠肉瘤急性反转录病毒中分离出来的，发现它们能够进行细胞转化，该基因在真核细胞的生长过程中起着重要的作用。遗传学、生化及分子生物学等方面的研究表明，K-ras基因在细胞外刺激所产生的信号传导通路中处于中枢地位，K-ras基因活性物与细胞增殖、凋亡之间关系密切。K-ras基因突变使本应正常死亡的细胞的生存期延长，还能增加抗药物和紫外光诱导的凋亡。结肠癌、肺癌、胰腺癌常带有K-ras基因突变，K-ras基因第12、13位密码子突变约占其突变的95％，其它突变在第61等密码子上。K-ras基因在燕麦细胞癌中突变率占33％，结肠癌占44％，胰腺癌占90％。K-ras是最容易被激活的原癌基因之一，在所有人类肿瘤中K-ras突变率能达到17％至25％。K-ras基因易激活的主要区域包括密码子12、13、25、61和63。这些突变激活能导致RAS蛋白聚集，影响GTP结合状态，从而抑制GTP酶活性和阻抑GTP酶激活蛋白。利用K-ras基因在临床上可对肿瘤(包括癌前病变)进行诊断，预后评估和治疗。通过检测基因突变来推测肿瘤所处的阶段和分化的程度，从而对病情和预后进行评估。随着现在医药行业的发展，已开发出针对肿瘤病变的多种阻断细胞信号通路的药物，但是在使用这些药物时需要确保该信号通路的下游信号分子没有发生激活突变，而这往往正是现在医疗行业需面对的问题，急需一种快速、简便、安全、高灵敏、高通量和低成本的K-ras基因突变检测来辅助这些药物的临床运用。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于检测K-RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒。本发明的技术方案如下：一种用于检测K-RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括：K引物组、E-4引物组、K检测探针、E-4检测探针和内标检测探针；K检测探针和E-4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E-4检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；其中，K引物组由正向引物K-M1-F、K-M2-F、K-M3-F、K-M4-F、K-M5-F、K-M6-F、K-M7-F和反向引物K-M-R组成，依次包括如SEQIDNO01至08所示的序列；E-4引物组由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R组成，依次包括如SEQIDNO09和10所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：K引物组的一正向引物和一反向引物K检测探针和/或E-4检测探针E-4引物组内标检测探针1×PCR缓冲液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，64℃退火20s，72℃延伸15s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环，后30个循环在退火时检测荧光信号。在本发明的一个优选实施方案中，所述K检测探针为K-P-C，包括如SEQIDNO11所示的序列。在本发明的一个优选实施方案中，所述E-4检测探针为E-4-P，所述内标检测探针为E-4-I，均包括如SEQIDNO12所示的序列。上述各因物及探针具体序列如下表所示：进一步优选的，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ。本发明的有益效果：1、本发明的试剂盒可用于辅助临床医生筛选出可受益于Cetuximab(爱必妥)和Panitumumab(帕尼单抗)等药物的大肠癌等癌症患者，适合于患者在进入个体化靶向治疗疗程之前使用，可为患者个体用药提供用药科学依据，降低治疗风险以及患者负担。2、本发明以人类K-RAS基因突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测K-RAS基因突变，而且检测突变的能力高。附图说明图1为本发明实施例2的多重荧光PCR反应程序图。图2为本发明实施例2中多重荧光PCR检测K-RAS基因GLY12ASP突变阴性对照样品检测曲线图。图3为本发明实施例2中多重荧光PCR检测K-RAS基因GLY12ASP突变的样品检测曲线图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。一种用于检测K-RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括：K引物组、E-4引物组、K检测探针、E-4检测探针和内标检测探针；K检测探针和E-4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E-4检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；优选的，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ；其中，K引物组由正向引物K-M1-F、K-M2-F、K-M3-F、K-M4-F、K-M5-F、K-M6-F、K-M7-F和反向引物K-M-R组成，依次包括如SEQIDNO01至08所示的序列；E-4引物组由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R组成，依次包括如SEQIDNO09和10所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：K引物组的一正向引物和一反向引物K检测探针和/或E-4检测探针E-4引物组内标检测探针1×PCR缓冲液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，64℃退火20s，72℃延伸15s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环，后30个循环在退火时检测荧光信号。所述K检测探针为K-P-C，包括如SEQIDNO11所示的序列。所述E-4检测探针为E-4-P，所述内标检测探针为E-4-I，均包括如SEQIDNO12所示的序列。上述各因物及探针具体序列如下表所示：实施例1本实施例以人类K-RAS基因外显子2的GLY12ASP突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测GLY12ASP突变，而且检测突变的能力高达1％。野生型细胞系H460的基因组DNA为野生型模板，以GLY12ASP突变质粒为阳性对照模板，以本试剂盒进行多重PCR检测，最终以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的标准(本实施例中的第一荧光报告基团为FAM，第二荧光报告基团为VIC、ROX或HEX，第一和第二荧光猝灭基团均为BHQ)。上述多重荧光PCR检测的扩增反应体系为：以上试剂组分：1×PCR缓冲液，MgCl2，Taq酶，dNTP均购自中国大连宝生物公司。上述多重荧光PCR检测的反应条件是95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环，后30个循环在退火时检测第一荧光报告基团和第二荧光报告基团的荧光信号。上述检测第一荧光报告基团和第二荧光报告基团的荧光信号的Ct值，是采用Mx3000P荧光PCR扩增仪或Mx3005P荧光PCR扩增仪或ABI7500荧光PCR扩增仪。，一次可检测96份样品(包括阴阳性对照)。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的第一荧光报告基团和第二荧光报告基团荧光强度，以第二荧光报告基团的信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，第一荧光报告基团的信号结果可信；以第一荧光报告基团的信号达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或30：阴性；Ct小于30：阳性。实施例2本实施例中以K-RAS基因热点突变外显子2上的GLY12ASP突变为例来分析本发明的多重荧光PCR检测K-RAS基因21外显子GLY12ASP突变的方法。实验用细胞系3株和1个质粒，分别为H460(K-RAS基因野生型)、293T(K-RAS基因野生型)、SW480(K-RAS基因野生型)和GLY12ASP突变质粒；45份健康的无偿献血者全血样品、45份临床肺癌样品(包括新鲜组织、石蜡切片、胸腔积液、全血)。利用上述荧光PCR检测K-RAS基因外显子2上的GLY12ASP突变的方法包括以下步骤：(1)样品处理和模板提取质控：样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液等标本。新鲜病理组织，取绿豆大小，约1g重，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，或已经制成的5～8μm切片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用Qiagen公司石蜡包埋DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。全血、血浆、血清以及胸腔积液样品，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取全血200μl，血浆、血清以及胸腔积液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH8.0)调整DNA浓度到100ng/μl或2ng/μl作为PCR扩增的模板。(2)用本发明的多重荧光PCR试剂盒(本实施例中的第一荧光报告基团为FAM，第二荧光报告基团为VIC、ROX或HEX，第一和第二荧光猝灭基团均为BHQ)对步骤(1)所得的模板进行荧光PCR扩增检测，配制反应体系：序号物料物料浓度用量(μL)11×PCR缓冲液1×102MgCl225mM83dNTPs10mM54K-M1-F50mM25K-M-R50mM0.16K-P-C-FAM50mM0.17E-4-F50mM0.18E-4-R50mM0.19内标检测探针50mM0.110Taq酶5U0.511H2O纯化水18.912DNA模板2ng/ul513总体积50所述荧光PCR的反应条件如图1所示：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环。(3)检测：采用Mx3000P实时PCR扩增仪(StrataGene公司)后30个循环退火阶段检测第一荧光报告基团和第二荧光报告基团荧光信号，一次可以检测92份样品(包括阴阳性对照)。结果判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的第一荧光报告基团和第二荧光报告基团荧光强度，以第二荧光报告基团信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，第一荧光报告基团信号结果可信；以第一荧光报告基团的信号达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或30：阴性；Ct小于30：阳性，检测结果具体如图2和图3所示。前述45份健康献血者全血样品以及细胞系H460(K-RAS基因野生型)、293T(K-RAS基因野生型)、SW480(K-RAS基因野生型)，GLY12ASP突变质粒经本发明的体系检测，只有GLY12ASP突变质粒有荧光信号，其他样品无荧光信号，进一步证明了荧光PCR的特异性。灵敏度分析：将突变型GLY12ASP突变质粒从10的4次方连续10倍梯度稀释，分别为10的3次方，10的2次方，10的1次方，10的0次方。每次反应加入5μLDNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，5拷贝DNA基因组即可检出。选择性能力分析：固定每次PCR反应总DNA用量，100ng/反应和10ng/反应。先将GLY12ASP突变质粒DNA和野生型细胞系(H460)DNA浓度都调整为20ng/μL和2ng/μL。这样每个反应加5μL模板即为100ng/反应和10ng/反应。按下述方法配置模拟DNA模板。A：50％即为10的3次方GLY12ASP突变细胞DNA。B：30％取A液60μL后混入40μL10的3次方GLY12ASP突变细胞DNA，震荡混均。C：20％取A液40μL后混入60μL10的3次方GLY12ASP突变细胞DNA，震荡混均。D：15％取B液50μL后混入50μL10的3次方GLY12ASP突变细胞DNA，震荡混均。E：10％取C液50μL后混入50μL10的3次方GLY12ASP突变细胞DNA，震荡混均。F：5％取E液50μL后混入50μL10的3次方GLY12ASP突变细胞DNA，震荡混均。G：1％取F液20μL后混入80μL10的3次方GLY12ASP突变细胞DNA，震荡混均。H：0.5％取G液50μL后混入50μL10的3次方GLY12ASP突变细胞DNA，震荡混均。I：0.1％取H液20μL后混入80μL10的3次方GLY12ASP突变细胞DNA，震荡混均。结果表明本发明的荧光PCR方法的选择性检测能力为在10ng总DNA中可以检出5拷贝的突变DNA，检测能力为1％。重复性试验：每个反应分别加入突变GLY12ASP质粒DNA10ng、1ng和100pg，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.1个循环。收集手术切除的肺癌标本，全血和血浆标本以及胸水标本共45例，其中30组织样品，5例血浆，5例胸水，5例全血。其中男性31例，女性14例。年龄为36-71岁，平均年龄为55岁。对于外显子2的GLY12ASP突变，本发明检测结果与DNA测序结果完全一致：45例样品中有12例发生外显子2的GLY12ASP突变，33例均为野生型。本发明可以同时检测K-RAS外显子2deGLY12ASP突变，检测时间仅需90min，因此本发明准、简单、快捷可满足突变的快速诊断。而且，多重荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法，10ng样品DNA中含1％的突变DNA即可检出。本领域普通技术人员可知，用本发明的试剂盒中的K引物组的其他正向引物检测其他相应基因突变，仍然能够得到与上述实施例相同或相近的技术效果，仍然属于本发明的保护范围。以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。<110>厦门飞朔生物技术有限公司<120>一种用于检测K-RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒<160>12<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>1aatataaacttgtggtagttggagccga28<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2taaacttgtggtagttggagccgc24<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>3tataaacttgtggtagttggagccgt26<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>4ataaacttgtggtagttggagcca24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>5ataaacttgtggtagttggagccc24<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>6tataaacttgtggtagttggagcct25<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>7taaacttgtggtagttggagctggtta27<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>8accagtaatatgcatattaaaacaagat28<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>9gactctgaagatgtacctatggtccta27<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10cttcttgctaagtcctgagcctgt24<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>11aggcaagagtgccttgacgatac23<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>12tgtgatttgccttctagaacagtaga26当前第1页1 2 3