一种用于检测B‑RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种用于检测B-RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒。
背景技术：
：B-raf基因全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌(V-raf)致癌同源体B1，定位于人染色体7q34，其具有功能的编码区由2150对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从Ras转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。B-raf基因突变能激活ERK信号，诱导细胞增殖，防止细胞凋亡。约70％的恶性黑色素瘤和15％的结肠癌中存在体细胞B-raf基因错义突变。B-raf基因作为raf-MEK-ERK信号转导通路中的重要成员，在肿瘤细胞增殖、分化和凋亡等方面发挥重要作用。正常的B-raf蛋白的功能是传递来自细胞膜的信号。B-raf蛋白通常只在需要传递信号时保持活性状态。然而，突变的B-raf则一直保持活性状态，并因此干扰了细胞信号传递链的正常功能，引起细胞的异常。利用B-raf基因在临床上可对肿瘤(包括癌前病变)进行诊断，预后评估和治疗。通过检测基因突变来推测肿瘤所处的阶段和分化的程度，从而对病情和预后进行评估。随着现在医药行业的发展，已开发出针对肿瘤病变的多种阻断细胞信号通路的药物，但是在使用这些药物时需要确保该信号通路的下游信号分子没有发生激活突变，而这往往正是现在医疗行业需面对的问题，急需一种快速、简便、安全、高灵敏、高通量和低成本的B-raf基因突变检测来辅助这些药物的临床运用。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于检测B-RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒。本发明的技术方案如下：一种用于检测B-RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括：B引物组、E-4引物组、B检测探针、E-4检测探针和内标检测探针；B检测探针和E-4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E-4检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；其中，B引物组由正向引物B-M-F和反向引物B-M-R组成，依次包括如SEQIDNO01和02所示的序列；E-4引物组由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R组成，依次包括如SEQIDNO03和04所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：B引物组B检测探针和/或E-4检测探针E-4引物组内标检测探针1×PCR缓冲液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，64℃退火20s，72℃延伸15s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。在本发明的一个优选实施方案中，所述B检测探针为B-P-C，包括如SEQIDNO05所示的序列。在本发明的一个优选实施方案中，所述E-4检测探针为E-4-P，所述内标检测探针为E-4-I，均包括如SEQIDNO06所示的序列。上述物及探针具体序列如下表所示：进一步优选的，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ。本发明的有益效果：1、本发明的试剂盒适合于患者在进入个体化靶向治疗疗程之前使用。可为患者个体用药提供用药科学依据，降低治疗风险以及患者负担。2、本发明以人类B-RAF基因突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测B-RAF基因突变，而且检测突变的能力高。附图说明图1为本发明实施例2的多重荧光PCR反应程序图。图2为本发明实施例2中多重荧光PCR检测B-RAF基因V600E突变阴性对照样品检测曲线图。图3为本发明实施例2中多重荧光PCR检测B-RAF基因V600E突变的样品检测曲线图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。一种用于检测B-RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括：B引物组、E-4引物组、B检测探针、E-4检测探针和内标检测探针；B检测探针和E-4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E-4检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；优选的，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ，其中，B引物组由正向引物B-M-F和反向引物B-M-R组成，依次包括如SEQIDNO01和02所示的序列；E-4引物组由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R组成，依次包括如SEQIDNO03和04所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：B引物组B检测探针和/或E-4检测探针E-4引物组内标检测探针1×PCR缓冲液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，64℃退火20s，72℃延伸15s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。所述B检测探针为B-P-C，包括如SEQIDNO05所示的序列。所述E-4检测探针为E-4-P，所述内标检测探针为E-4-I，均包括如SEQIDNO06所示的序列。上述物及探针具体序列如下表所示：名称序列B-M-FGTGATTTTGGTCTAGCTACAGAB-M-RCTCAGCAGCATCTCAGGE-4-FGACTCTGAAGATGTACCTATGGTCCTAE-4-RCTTCTTGCTAAGTCCTGAGCCTGTB-P-CCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGE-4-PTGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAE-4-ITGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGA实施例1本实施例以人类B-RAF基因V600的V600E突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测V600E突变，而且检测突变的能力高达1％。野生型细胞系H460的基因组DNA为野生型模板，以V600E突变质粒为阳性对照模板，以上述用于检测B-RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒进行多重PCR检测，最终以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的标准(本实施例中的第一荧光报告基团为FAM，第二荧光报告基团为VIC、ROX或HEX，第一和第二荧光猝灭基团均为BHQ)。上述多重荧光PCR检测的扩增反应体系为：序号物料物料浓度用量(μL)11×PCR缓冲液1×102MgCl225mM83dNTPs10mM54B-M-F50mM25B-M-R50mM0.16B-P-C-FAM50mM0.17E-4-F50mM0.18E-4-R50mM0.19内标检测探针50mM0.110Taq酶5U0.511H2O纯化水18.912DNA模板2ng/ul513总体积50以上试剂组分：1×PCR缓冲液，MgCl2，Taq酶，dNTP均购自中国大连宝生物公司。上述多重荧光PCR检测的反应条件是95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环，后30个循环在退火时检测第一荧光报告基团和第二荧光报告基团的荧光信号。上述检测第一荧光报告基团和第二荧光报告基团的荧光信号的Ct值，是采用Mx3000P荧光PCR扩增仪或Mx3005P荧光PCR扩增仪或ABI7500荧光PCR扩增仪。，一次可检测96份样品(包括阴阳性对照)。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的第一荧光报告基团和第二荧光报告基团荧光强度，以第二荧光报告基团的信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，第一荧光报告基团的信号结果可信；以第一荧光报告基团的信号达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或30：阴性；Ct小于30：阳性。实施例2本实施例中以B-RAF基因热点突变V600上的V600E突变为例来分析本发明的多重荧光PCR检测B-RAF基因V600的V600E突变的方法。实验用细胞系3株和1个质粒，分别为H460(B-RAF基因野生型)、293T(B-RAF基因野生型)、SW480(B-RAF基因野生型)和V600E突变质粒；45份健康的无偿献血者全血样品、45份临床肺癌样品(包括新鲜组织、石蜡切片、胸腔积液、全血)。利用上述荧光PCR检测B-RAF基因V600上的V600E突变的方法包括以下步骤：(1)样品处理和模板提取质控：样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液等标本。新鲜病理组织，取绿豆大小，约1g重，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，或已经制成的5～8μm切片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用Qiagen公司石蜡包埋DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。全血、血浆、血清以及胸腔积液样品，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取全血200μl，血浆、血清以及胸腔积液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH8.0)调整DNA浓度到100ng/μl或2ng/μl作为PCR扩增的模板。(2)用本发明的多重荧光PCR试剂盒(本实施例中的第一荧光报告基团为FAM，第二荧光报告基团为VIC、ROX或HEX，第一和第二荧光猝灭基团均为BHQ)对步骤(1)所得的模板进行荧光PCR扩增检测，配制反应体系：所述荧光PCR的反应条件如图1所示：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环。(3)检测：采用Mx3000P实时PCR扩增仪(StrataGene公司)后30个循环退火阶段检测第一荧光报告基团和第二荧光报告基团荧光信号，一次可以检测92份样品(包括阴阳性对照)。结果判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的第一荧光报告基团和第二荧光报告基团荧光强度，以第二荧光报告基团信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，第一荧光报告基团信号结果可信；以第一荧光报告基团的信号达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或30：阴性；Ct小于30：阳性，检测结果具体如图2和图3所示。前述45份健康献血者全血样品以及细胞系H460(B-RAF基因野生型)、293T(B-RAF基因野生型)、SW480(B-RAF基因野生型)，V600E突变质粒经本发明的体系检测，只有V600E突变质粒有荧光信号，其他样品无荧光信号，进一步证明了荧光PCR的特异性。灵敏度分析：将突变型V600E突变质粒从10的4次方连续10倍梯度稀释，分别为10的3次方，10的2次方，10的1次方，10的0次方。每次反应加入5μLDNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，5拷贝DNA基因组即可检出。选择性能力分析：固定每次PCR反应总DNA用量，100ng/反应和10ng/反应。先将V600E突变质粒DNA和野生型细胞系(H460)DNA浓度都调整为20ng/μL和2ng/μL。这样每个反应加5μL模板即为100ng/反应和10ng/反应。按下述方法配置模拟DNA模板。A：50％即为10的3次方V600E突变细胞DNA。B：30％取A液60μL后混入40μL10的3次方V600E突变细胞DNA，震荡混均。C：20％取A液40μL后混入60μL10的3次方V600E突变细胞DNA，震荡混均。D：15％取B液50μL后混入50μL10的3次方V600E突变细胞DNA，震荡混均。E：10％取C液50μL后混入50μL10的3次方V600E突变细胞DNA，震荡混均。F：5％取E液50μL后混入50μL10的3次方V600E突变细胞DNA，震荡混均。G：1％取F液20μL后混入80μL10的3次方V600E突变细胞DNA，震荡混均。H：0.5％取G液50μL后混入50μL10的3次方V600E突变细胞DNA，震荡混均。I：0.1％取H液20μL后混入80μL10的3次方V600E突变细胞DNA，震荡混均。结果表明本发明的荧光PCR方法的选择性检测能力为在10ng总DNA中可以检出5拷贝的突变DNA，检测能力为1％。重复性试验：每个反应分别加入突变V600E质粒DNA10ng、1ng和100pg，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.1个循环。收集手术切除的肺癌标本，全血和血浆标本以及胸水标本共45例，其中30组织样品，5例血浆，5例胸水，5例全血。其中男性31例，女性14例。年龄为36-71岁，平均年龄为55岁。对于V600的V600E突变，本发明检测结果与DNA测序结果完全一致：45例样品中有12例发生V600的V600E突变，33例均为野生型。本发明多重荧光PCR反应就可以同时检测B-RAF外显子V600V600E突变，检测时间仅需90min，因此本发明准、简单、快捷可满足突变的快速诊断。而且，多重荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法，10ng样品DNA中含1％的突变DNA即可检出。以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。<110>厦门飞朔生物技术有限公司<120>一种用于检测B-RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒<160>6<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1gtgattttggtctagctacaga22<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>2ctcagcagcatctcagg17<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>3gactctgaagatgtacctatggtccta27<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>4cttcttgctaagtcctgagcctgt24<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>5cccatcagtttgaacagttgtctgg25<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>6tgtgatttgccttctagaacagtaga26当前第1页1 2 3