一种辅助鉴定大豆百粒重性状的分子标记HNUSOY05及其应用的制作方法

本发明涉及一种辅助鉴定大豆百粒重性状的分子标记HNUSOY05及其应用，属于作物遗传育种技术领域。

背景技术：

大豆是世界上重要的经济与粮食作物，是食用油和植物蛋白的主要来源之一，因此，大豆的遗传改良工作一直受到遗传学和育种学工作者的重点关注。其中，产量性状具有重要的经济价值，成为人们改良的热点问题。大豆籽粒百粒重是其产量性状构成的重要因素，与产量呈现正相关，是高产大豆选育过程中重要的选育对象。但是，大豆籽粒百粒重性状是一个遗传力较高的数量性状，受多基因控制，表型选育方式效率较低，且易受环境影响，不稳定。随着大豆公共遗传连锁图谱的不断完善，已有很多遗传学和育种学工作者通过QTL定位等方式发现了230多个籽粒百粒重性状相关的QTL。然后，这些已经公布的QTL多采用SSR类分子标记定位，在大豆选育过程中，实验操作复杂，时间和人力成本较高。同时，由于大豆是严格自花授粉作物、且花期分散，导致不同大豆种质间遗传背景差异较大。通过QTL定位方式发掘的籽粒百粒重性状的分子标记对遗传背景依赖程度高，对相同遗传材料(即具有相同遗传背景的大豆群体)，或相近遗传材料，具有良好的鉴定和选择作用，而对遗传背景差异较大的育种材料检出效率较差，推广范围有限，实际应用程度不高。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种辅助鉴定大豆百粒重性状的分子标记HNUSOY05，采用的技术方案如下：

本发明的一个目的在于提供一种辅助鉴定大豆百粒重性状的分子标记HNUSOY05，所述分子标记表现为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列在大豆11号染色体的1001963至1002153区间内插入/缺失长度多态性；具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的大豆表现为高百粒重；缺失SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的大豆表现为低百粒重。

该分子标记HNUSOY05的片段长度为191bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

本发明还提供了一种所述分子标记HNUSOY05在大豆遗传育种、大豆百粒重性状辅助鉴定、大豆百粒重性状筛选中的应用。

本发明的另一目的是提供一种所述分子标记HNUSOY05的引物对，所述引物对的上游引物HNUSOY05F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物HNUSOY05R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种所述分子标记HNUSOY05的引物对在大豆遗传育种、大豆百粒重性状辅助鉴定、大豆百粒重性状筛选中的应用。

本发明的再一目的是提供一种利用分子标记HNUSOY05鉴定大豆百粒重性状的方法，该方法是以待测大豆基因组DNA为模板，利用权利要求3所述分子标记HNUSOY05的引物对进行PCR扩增；扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳检测；若检测得到长度为637bp的单一片段，则待测大豆品种具有高百粒重性状；若检测得到长度为446bp的单一片段，则待测大豆品种具有低百粒重性状。

本发明中所述高百粒重是指籽粒的百粒重≥20.0克；所述低百粒重是指籽粒百粒重≤12.0克。

优选地，所述方法，具体步骤如下：

1)提取待检测大豆样品中的基因组DNA；

2)以步骤1)所得的待检测大豆样品基因组DNA为模板，利用分子标记HNUSOY05的引物对进行PCR扩增反应，获得PCR产物；每25μL所述PCR反应体系包含2.5mmol/L MgCl₂、1U rTaq酶、800μmol/L dNTP、0.2μmol/L上游引物HNUSOY05F和下游引物HNUSOY05R、50ng模板基因组DNA；

3)利用步骤2)所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；若检测得到长度为637bp的单一片段，则待测大豆品种具有高百粒重性状；若检测得到长度为446bp的单一片段，则待测大豆品种具有低百粒重性状。

优选地，步骤2)所述PCR扩增反应为降落PCR扩增反应。

更优选地，所述降落PCR扩增反应的程序为94℃预变性7min；94℃变性20s，60℃退火20s，每个循环降0.5℃，72℃延伸30s，30个循环；94℃变性20s，45℃退火20s，72℃延伸30s，10个循环；72℃终延伸7min。

在高百粒重的大豆中核苷酸扩增产物长度为637bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在低百粒重的大豆中核苷酸扩增产物长度为446bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明有益效果：

利用本发明提供的分子标记HNUSOY05来鉴定大豆百粒重性状表现(高百粒重性状或低百粒重性状)操作简单、费用低、精确度高，可实现快速检测；在大豆育种过程中，可以利用本发明提供的分子标记HNUSOY05对大豆亲本或中间育种材料进行PCR扩增鉴定，选择扩增产物长度为637bp的亲本或者育种材料，筛选出具有高百粒重性状的大豆种质材料，将极大地提高了大豆百粒重性状的选育效率，在高产大豆品种的培育过程中具有重要应用价值。本发明无需酶切过程即可鉴定出大豆百粒重性状，鉴定时间短，效率高。

附图说明

图1为分子标记HNUSOY05在不同大豆品种中扩增后的电泳图；

(Marker DL2000；1，绥农14；2，科丰-1号；3，南农1138-2；4，固新野生大豆；5，Acher；6，Evans；7，Peking；8，PI209332；9，合丰25)。

图2为分子标记HNUSOY05在84个大豆品种中扩增后的电泳图；

(M，Marker DL15000；1，ZDD03458；2，ZDD03515；3，ZDD08254；4，ZDD10058；5，ZDD01818；6，ZDD10039；7，ZDD10024；8，ZDD01892；9，ZDD18591；10，ZDD01291；11，ZDD07482；12，ZDD23177；13，ZDD01417；14，ZDD23601；15，ZDD01884；16，ZDD18365；17，ZDD00638；18，ZDD18525；19，ZDD19070；20，ZDD01124；21，ZDD17731；22，ZDD18887；23，ZDD17700；24，ZDD23175；25，ZDD17920；26，ZDD01909；27，ZDD18348；28，ZDD02450；29，ZDD03684；30，ZDD08487；31，ZDD08505；32，ZDD01855；33，ZDD02447；34，ZDD00745；35，ZDD11323；36，ZDD18087；37，ZDD02529；38，ZDD08459；39，ZDD20207；40，ZDD23090；41，ZDD18617；42，ZDD03056；43，ZDD06834；44，ZDD08257；45，ZDD01890；46，ZDD11092；47，ZDD08511；48，ZDD09224；49，ZDD18610；50，WDD00475；51，ZDD19861；52，ZDD22643；53，ZDD09417；54，ZDD22671；55，ZDD00738；56，ZDD09462；57，WDD00410；58，ZDD00712；59，ZDD08250；60，ZDD08502；61，ZDD18518；62，ZDD17873；63，ZDD20449；64，ZDD00072；65，ZDD09301；66，ZDD00159；67，ZDD06067；68，ZDD01889；69，WDD00472；70，ZDD09226；71，ZDD01521；72，ZDD07948；73，ZDD18790；74，ZDD02258；75，ZDD00707；76，ZDD07864；77，ZDD03209；78，ZDD03279；79，ZDD19699；80，ZDD10100；81，WDD00477；82，ZDD22763；83，ZDD23174；84，ZDD22712)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1：

本实施例提供一种辅助鉴定大豆百粒重性状的分子标记HNUSOY05，所述分子标记表现为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列在大豆11号染色体的1001963至1002153区间内插入/缺失长度多态性；具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的表现为高百粒重；缺失SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的表现为低百粒重。

插入或缺失突变的核苷酸片段位于大豆11号染色体的1001963至1002153区间，片段长度为191bp，具体核苷酸序列(SEQ ID NO.1)为：

ATATGGTCTATTCTGTTGAGGGCGAGCCCTGGTGCAGCGGTAAAGTTGTGCCTTGGTGACTTGTTGGTCATGGGTTCGAATCCGGAAACAGCGTCTTTGCATATGCAAGGGTAAGGCTGCGTACAACATCCCTCCCCCATACCTTCGCATAGCGAAGAGCCTCCGGGCAATGGGGTACGAAGTAAAAGTAA

根据大豆基因组序列，利用软件Primer3，设计用于扩增分子标记HNUSOY05的引物对，得到分子标记HNUSOY05的PCR检测引物对，该引物对包括如下两条核苷酸序列：

HNUSOY05F(SEQ ID NO.2)：5’-GGGTTTGGTTTGAGGTTTCTCG-3’；

HNUSOY05R(SEQ ID NO.3)：5’-ATCAATAACCTGAGCATGGCAC-3’。

实施例2

本实施例提供了一种大豆的分子标记的检测方法，包括以下步骤：提取待检测大豆样品中的基因组DNA，以待测大豆基因组DNA为模板，将上述引物对上述DNA模板进行PCR扩增：其中，25μL PCR反应体系含2.5mmol L^-1MgCl₂、1U rTaq酶、800μmol L^-1dNTP、0.2μmol L^-1引物F和R、模板基因组DNA 50ng；采用降落PCR(touchdown PCR，TD-PCR)进行扩增，程序为94℃预变性7min；94℃变性20s，60℃退火20s，每个循环降0.5℃，72℃延伸30s，30个循环；94℃变性20s，45℃退火20s，72℃延伸30s，10个循环；72℃终延伸7min。PCR产物采用1.5％琼脂糖电泳。

利用实施例1中的引物对在不同大豆品种中进行扩增，然后电泳，如图1所示，图中M为Marker DL2000；1，绥农14；2，科丰-1号；3，南农1138-2；4，固新野生大豆；5，Acher；6，Evans；7，Peking；8，PI209332；9，合丰25。

电泳结果参照附图1，产物大小如泳道7所示，通过送交上海生物工程有限公司进行DNA测序分析，鉴定PCR产物长度为637bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

GGGTTTGGTTTGAGGTTTCTCGACCTGAAAGAGAAACTATCCTGTAAAAATTATTAGCACTCTTAAACATTGGCCTTGTCTAATCCTGTTGTTTTGAGTTCCCATTTCTATGGATTATTTCAGATAAGCTTCTCAACAAACACTTGTAGTTGTAGGAGAAGGAAATAAGGAGGGAGAACAAATCAGACTTTTCTCATAAGTTGAAATCAACTTATTCAGAAACTCTCATCTATTTTCCAAAAGTTGAAGTGAATAACTTGATTATAACTTATTGGAGAAGTTTGATTTTACCTCCCTATTTCTTCTTTTACAAATGTTTGTTGAGAAGTTTATCCTAACTGAGCCTATGTTTGTGGGGAATACCACTATTTTTGCACACCGAGTTTTAATATTTTATATGGTCTATTCTGTTGAGGGCGAGCCCTGGTGCAGCGGTAAAGTTGTGCCTTGGTGACTTGTTGGTCATGGGTTCGAATCCGGAAACAGCGTCTTTGCATATGCAAGGGTAAGGCTGCGTACAACATCCCTCCCCCATACCTTCGCATAGCGAAGAGCCTCCGGGCAATGGGGTACGAAGTAAAAGTAAATATGGTCTATTCTGTTGTGTAGATCAATGTGCCATGCTCAGGTTATTGAT。

产物通过琼脂糖凝胶电泳检测如泳道3所示，通过送交上海生物工程有限公司进行DNA测序分析，鉴定PCR产物长度为446bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：

GGGTTTGGTTTGAGGTTTCTCGACCTGAAAGAGAAACTATCCTGTAAAAATTATTAGCACTCTTAAACATTGGCCTTGTCTAATCCTGTTGTTTTGAGTTCCCATTTCTATGGATTATTTCAGATAAGCTTCTCAACAAACACTTGTAGTTGTAGGAGAAGGAAATAAGGAGGGAGAACAAATCAGACTTTTCTCATAAGTTGAAATCAACTTATTCAGAAACTCTCATCTATTTTCCAAAAGTTGAAGTGAATAACTTGATTATAACTTATTGGAGAAGTTTGATTTTACCTCCCTATTTCTTCTTTTACAAATGTTTGTTGAGAAGTTTATCCTAACTGAGCCTATGTTTGTGGGGAATACCACTATTTTTGCACACCGAGTTTTAATATTTTATATGGTCTATTCTGTTGTGTAGATCAATGTGCCATGCTCAGGTTATTGAT。

实施例3

根据大豆百粒重性状数据，将供试大豆品种分成两组：高百粒重组(百粒重≥20.0克，32个)和低百粒重组(百粒重≤12.0克，52个)。在供试大豆品种中，检测到长度为637bp的单一片段的大豆品种的平均百粒重为23.38克(平均百粒重是具有长度为637bp的单一片段的所有大豆品种百粒重性状的算术平均数)；检测到446bp的DNA片段的大豆品种的平均百粒重为8.87克(平均百粒重是具有长度为446bp的单一片段的所有大豆品种百粒重性状的算术平均数)；在本发明所研究的大豆品种中，具有长度为637bp的单一片段的百粒重性状平均值比具有长度为446bp的单一片段的百粒重性状平均值高14.55克。在32个具有高百粒重性状的大豆品种中，均检测出长度为637bp的单一片段；而在52个具有低百粒重性状的大豆品种中，全部检测出长度为446bp的单一片段；因此，本发明的分子标记及其检测方法可以用于大豆百粒重性状的鉴定，辅助选育具有高百粒重性状的大豆品种。

通过上述实验结果可知，利用本发明提供的分子标记及其引物来鉴定大豆百粒重性状的准确率高达100％。

表1高百粒重组与低百粒重组大豆材料的百粒重性状和PCR扩增产物

以上检测大豆品种可以凭借登录号信息通过国家作物种质资源数据库(http://www.cgris.net/)免费获得，百粒重性状数据也可以通过国家作物种质资源数据库检索获得；PCR产物大小可以根据琼脂糖电泳检测结果进行判断，如附图2所示，图中M为Marker DL15000；1，ZDD03458；2，ZDD03515；3，ZDD08254；4，ZDD10058；5，ZDD01818；6，ZDD10039；7，ZDD10024；8，ZDD01892；9，ZDD18591；10，ZDD01291；11，ZDD07482；12，ZDD23177；13，ZDD01417；14，ZDD23601；15，ZDD01884；16，ZDD18365；17，ZDD00638；18，ZDD18525；19，ZDD19070；20，ZDD01124；21，ZDD17731；22，ZDD18887；23，ZDD17700；24，ZDD23175；25，ZDD17920；26，ZDD01909；27，ZDD18348；28，ZDD02450；29，ZDD03684；30，ZDD08487；31，ZDD08505；32，ZDD01855；33，ZDD02447；34，ZDD00745；35，ZDD11323；36，ZDD18087；37，ZDD02529；38，ZDD08459；39，ZDD20207；40，ZDD23090；41，ZDD18617；42，ZDD03056；43，ZDD06834；44，ZDD08257；45，ZDD01890；46，ZDD11092；47，ZDD08511；48，ZDD09224；49，ZDD18610；50，WDD00475；51，ZDD19861；52，ZDD22643；53，ZDD09417；54，ZDD22671；55，ZDD00738；56，ZDD09462；57，WDD00410；58，ZDD00712；59，ZDD08250；60，ZDD08502；61，ZDD18518；62，ZDD17873；63，ZDD20449；64，ZDD00072；65，ZDD09301；66，ZDD00159；67，ZDD06067；68，ZDD01889；69，WDD00472；70，ZDD09226；71，ZDD01521；72，ZDD07948；73，ZDD18790；74，ZDD02258；75，ZDD00707；76，ZDD07864；77，ZDD03209；78，ZDD03279；79，ZDD19699；80，ZDD10100；81，WDD00477；82，ZDD22763；83，ZDD23174；84，ZDD22712。

表1中产物大小是通过前期DNA测序结果进行辅助判定。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 哈尔滨师范大学

<120> 一种辅助鉴定大豆百粒重性状的分子标记HNUSOY05及其应用

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 191

<212> DNA

<213> 插入或缺失突变的核苷酸片段

<400> 1

atatggtcta ttctgttgag ggcgagccct ggtgcagcgg taaagttgtg ccttggtgac 60

ttgttggtca tgggttcgaa tccggaaaca gcgtctttgc atatgcaagg gtaaggctgc 120

gtacaacatc cctcccccat accttcgcat agcgaagagc ctccgggcaa tggggtacga 180

agtaaaagta a 191

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> HNUSOY05F

<400> 2

gggtttggtt tgaggtttct cg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> HNUSOY05R

<400> 3

atcaataacc tgagcatggc ac 22

<210> 4

<211> 637

<212> DNA

<213> 高百粒重的大豆中PCR产物

<400> 4

gggtttggtt tgaggtttct cgacctgaaa gagaaactat cctgtaaaaa ttattagcac 60

tcttaaacat tggccttgtc taatcctgtt gttttgagtt cccatttcta tggattattt 120

cagataagct tctcaacaaa cacttgtagt tgtaggagaa ggaaataagg agggagaaca 180

aatcagactt ttctcataag ttgaaatcaa cttattcaga aactctcatc tattttccaa 240

aagttgaagt gaataacttg attataactt attggagaag tttgatttta cctccctatt 300

tcttctttta caaatgtttg ttgagaagtt tatcctaact gagcctatgt ttgtggggaa 360

taccactatt tttgcacacc gagttttaat attttatatg gtctattctg ttgagggcga 420

gccctggtgc agcggtaaag ttgtgccttg gtgacttgtt ggtcatgggt tcgaatccgg 480

aaacagcgtc tttgcatatg caagggtaag gctgcgtaca acatccctcc cccatacctt 540

cgcatagcga agagcctccg ggcaatgggg tacgaagtaa aagtaaatat ggtctattct 600

gttgtgtaga tcaatgtgcc atgctcaggt tattgat 637

<210> 5

<211> 446

<212> DNA

<213> 低百粒重的大豆中核苷酸扩增产物

<400> 5

gggtttggtt tgaggtttct cgacctgaaa gagaaactat cctgtaaaaa ttattagcac 60

tcttaaacat tggccttgtc taatcctgtt gttttgagtt cccatttcta tggattattt 120

cagataagct tctcaacaaa cacttgtagt tgtaggagaa ggaaataagg agggagaaca 180

aatcagactt ttctcataag ttgaaatcaa cttattcaga aactctcatc tattttccaa 240

aagttgaagt gaataacttg attataactt attggagaag tttgatttta cctccctatt 300

tcttctttta caaatgtttg ttgagaagtt tatcctaact gagcctatgt ttgtggggaa 360

taccactatt tttgcacacc gagttttaat attttatatg gtctattctg ttgtgtagat 420

caatgtgcca tgctcaggtt attgat 446