一种检测ABAT基因的引物组合、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及生物医学工程领域，且特别涉及一种检测ABAT基因的引物组合、试剂盒及应用。

背景技术：

γ-氨基丁酸GABA(γ-aminobutyric acid，GABA；)代谢途径是广泛存在于动植物和微生物中的TCA(Tricarboxylic Acid，TCA)循环一个代谢旁路；该代谢途径最早在马铃薯块茎中发现。GABA代谢途径主要由三个酶组成：谷氨酸脱羧酶GAD(Glutamate decarboxylase，GAD)、γ-氨基丁酸转氨酶GABA-T(γ-aminobutyric acid transaminases，GABA-T；在人体中简写为ABAT)和琥珀酸半醛脱氢酶SSADH(succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH)。GABA代谢途径起始于TCA循环中的α-酮戊二酸α-KG(α-Ketoglutarate，α-KG)经谷氨酸脱氢酶GDH(glutamate dehydrogenase，GDH)的催化生成谷氨酸Glu(glutamate，Glu)，谷氨酸经线粒体跨膜运输进入细胞质中；在细胞质中经谷氨酸脱羧酶GAD催化一个非可逆反应，生成γ-氨基丁酸GABA，γ-氨基丁酸GABA又经线粒体跨膜运输进入线粒体内；γ-氨基丁酸GABA经γ-氨基丁酸转氨酶GABA-T作用，生成琥珀酸半醛SSA(succinic semialdehyde，SSA)；琥珀酸半醛SSA再经琥珀酸半醛脱氢酶SSADH(succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH)的催化生成琥珀酸Succinate回到TCA循环中，而且SSADH催化的这一步反应是一个不可逆反应。

GABA途径在动植物和微生物中都发挥着重要的作用，尤其是与动植物及人类的生长发育密切相关。GABA途径在人体中与神经系统的发育和功能密切相关，GABA在脊椎动物中枢神经系统中是一种抑制性神经递质；在人体中GABA能通过神经活动调节降低血压的作用。GABA途径能保持大脑中兴奋和抑制间的平衡，在大脑线粒体中这一途径显得尤为重要。

人体GABA的缺乏和过度累积会导致非特异的神经系统功能紊乱，包括精神运动性阻滞、语言发育推迟和癫痫等。人体GABA的累积有可能是ABAT基因突变等原因造成，ABAT基因缺失导致GABA代谢受阻而累积，进一步影响神经系统功能。但是，如果ABAT基因序列本身正常，但是由于ABAT基因甲基化的影响，也会导致ABAT的转录翻译异常，进而影响GABA的代谢，导致GABA的累积。

目前，市场上几乎没有针对ABAT基因的检测手段，更少有针对ABAT基因序列甲基化和ABAT基因的检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种检测ABAT基因的引物组合，此引物组合能快速准确的检测ABAT基因，且该引物组合没有发夹结构、引物二聚体结构，反应灵敏，扩增片段长度合适；退火温度合适，无非特异性条带。

本发明的第二目的在于提供上述引物组合在制备用于ABAT基因突变检测的试剂中的应用。

本发明的第三目的在于提供上述引物组合在制备用于胎儿产前ABAT基因突变检测的试剂盒中的应用，该试剂盒能方便快捷、准确、特异性的鉴定ABAT基因，且该试剂盒的成本低廉，适合推广应用。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一种检测ABAT基因的引物组合，引物组合包括用于扩增SEQ ID NO.1所示的碱基序列的第1-1202位区段的第一引物对、用于扩增SEQ ID NO.1所示的碱基序列的第913-2414位区段的第二引物对和用于扩增SEQ ID NO.1所示的碱基序列的第2399-4412位区段的第三引物对；第一引物对的碱基序列如SEQ ID NO.2-3所示；第二引物对的碱基序列如SEQ ID NO.4-5所示；第三引物对的碱基序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

还包括用于扩增SEQ ID NO.8所示的碱基序列的第1344位－1529位区段的第四引物对，第四引物对的碱基序列如SEQ ID NO.9-10所示。

还包括用于扩增SEQ ID NO.8所示的碱基序列的第5006位－5403位区段的第五引物对，第五引物对的碱基序列如SEQ ID NO.11-12所示。

上述的任一项引物组合在制备用于ABAT基因突变检测的试剂中的应用。

上述任一项引物组合在制备用于ABAT基因突变检测的试剂盒中的应用。

上述的任一项引物组合在制备用于胎儿产前ABAT基因突变检测的试剂盒中的应用。

一种检测ABAT基因的试剂盒，试剂盒包含上述的检测ABAT基因的引物组合和/或上述的检测ABAT基因甲基化的引物组合。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：针对人体ABAT基因表达序列设计的引物能快速准确的检测该基因，针对ABAT基因序列设计的甲基化引物，能快速判断基因的甲基化情况；上述引物组合在胎儿产前检测及其试剂盒中的应用，能帮助检测快速检测ABAT基因；上述引物组合在制备ABAT基因检测试剂盒中的应用，具有更广泛的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例中的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明实验例中的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实验例中的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的检测ABAT的引物组合和检测ABAT基因甲基化的引物组合及应用作进一步的说明。

GABA在人体中，尤其是在神经系统中，具有重要的作用，如果GABA的水平异常，会导致神经系统功能紊乱。GABA的水平异常跟编码γ-氨基丁酸转氨酶ABAT基因异常有关。当ABAT基因存在缺失突变等情况会导致GABA水平的异常。然而，由于表观遗传的影响，即使ABAT基因的碱基序列为发生变化，但是如果序列发生甲基化，也会导致基因的表达异常，进而影响GABA水平的异常。

因此，发明人针对上述情况，设计了针对ABAT基因编码序列的引物组合和针对ABAT基因甲基化的药物组合。

一种检测ABAT基因的引物组合，引物组合包括用于扩增SEQ ID NO.1所示的碱基序列的第1-1202位区段的第一引物对、用于扩增SEQ ID NO.1所示的碱基序列的第913-2414位区段的第二引物对和用于扩增SEQ ID NO.1所示的碱基序列的第2399-4412位区段的第三引物对；第一引物对的碱基序列如SEQ ID NO.2-3所示；第二引物对的碱基序列如SEQ ID NO.4-5所示；第三引物对的碱基序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

该引物组合分为三段且具有交叉重叠的区段，交叉重叠即不会导致人为的遗漏而导致检测不准确；能全面准确的覆盖ABAT基因的全长，如果ABAT基因有缺失或者突变的情况，就能通过电泳或者测序的方法，知道具体的缺失或突变的具体位点。

进一步地，还包括用于扩增SEQ ID NO.8所示的碱基序列的第1344位－1529位区段的第四引物对，第四引物对的碱基序列如SEQ ID NO.9-10所示。

进一步地，还包括用于扩增SEQ ID NO.8所示的碱基序列的第5006位－5403位区段的第五引物对，第五引物对的碱基序列如SEQ ID NO.11-12所示。

基因组DNA经过重亚硫酸盐的处理后，通过上述检测ABAT基因甲基化的引物组合的扩增产物，能够通过测序和序列比对；如果序列的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，则判断该碱基未发生甲基化，如果胞嘧啶为转变成胸腺嘧啶，则该点发生了甲基化。通过此方法能快速的判断出ABAT基因的甲基化情况。

上述的引物组合在制备用于ABAT基因突变检测的试剂盒中的应用。

该试剂有利于大规模的推广应用，能在很大程度上降低胎儿检测的成本。

上述的引物组合在制备用于胎儿产前ABAT基因突变检测的试剂盒中的应用。

胎儿产前检测，更有利于得到健康的胎儿，而且对胎儿的健康状况有更明确的了解；或者可以提前准备好对策。

一种检测ABAT基因的试剂盒，包括上述任一项的引物组合。

进一步地，上述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、ddH₂O和200μL的PCR反应管中一种或多种。

进一步地，上述PCR反应缓冲液包括Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg²⁺和溴酚蓝。

进一步地，Taq DNA聚合酶为高保真的Taq DNA聚合酶。

在进行PCR反应的时候，使用高保真的Taq DNA聚合酶，能保真扩增的反应的时候，扩真的序列保持与模板的一致性。

进一步地，检测ABAT基因的试剂盒还包括重亚硫酸盐。

使用重亚硫酸盐处理目的基因片段，未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶；而甲基化的胞嘧啶则保持不变；通过PCR反应后，尿嘧啶转化成胸腺嘧啶，然后对PCR产物测序；通过比对测序结果，如果序列的胞嘧啶转变成了胸腺嘧啶，则该点未甲基化；如果胞嘧啶未发生转变则碱基发生了甲基化。通过此方法判断序列甲基化位点，精确度高，能找到片段中的每一个甲基化位点。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供检测ABAT基因的引物组合，包括用于扩增ABAT基因编码序列mRNA序列的第1-1202位区段的第一引物对、用于扩增ABAT基因编码序列mRNA序列的第913-2414位区段的第二引物对和用于扩增ABAT基因编码序列mRNA序列的第2399-4412位区段的第三引物对。第一引物对、第二引物对和第三引物对的序列如表1所示。

上述三对引物组合扩增的片段，覆盖ABAT基因编码序列mRNA全长序列。

本实施例提供的检测ABAT基因编码序列具体方法，具体如下：

第一部分，细胞样本的提取

1取样，通过羊水穿刺，抽取15-25nL的羊水，1500rpm离心5min，取沉淀；

2培养，将沉淀用培养基制成细胞悬液分别加入到两个细胞培养瓶中培养瓶，培养瓶中加有F10培养液2.1mL和小牛血清0.9mL，37培训箱静置培养6-7天；

3富集，用胰蛋白酶处理培养液，然后培养液转移到离心管中，1500rpm离心10min,弃上清液，沉淀的细胞样品保存备用；

第二部分胎儿细胞总RNA提取及反转录

1取第一部分获得细胞样品(50-100mg)液氮研磨，研磨过的样品加入到RNase-free的EP管中，每管用1mL的Trizol处理，静置5min；

2以12000rpm离心5min，弃沉淀，加入200μL的氯仿-异戊醇，震荡均匀后，静置15min；

3以4℃，12000rpm离心10min，吸取上清液至另外的RNase-free的EP管中，加入500μL异丙醇，混匀，-20℃放置25min；

4以4℃，12000rpm离心10min，弃上清；用75％的乙醇(RNase-free)1mL洗涤两次，晾干；

5加50μL的ddH₂O(RNase-free)溶解得到total RNA，-80℃保存备用；

6加反转录酶，dNTP，oligo dT primer，total RNA反转录得到cDNA样品。

第三部分ABAT基因编码序列的扩增

用第二部分第6步获得的cDNA样品为模板0.5μL，PCR反应Mix反应液10μL，引物对0.5μL/0.5μL，ddH₂O 8.5μL，混合均匀；

反应程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，55-65℃退火30s，72℃延伸1kb/min(延伸时间)，72℃延伸2min，35个循环。得到扩增产物，通过电泳观察结果。

第一引物对的退火温度为60℃，延伸时间为80s；第二引物对的退火温度为55℃，延伸时间为100s；第三引物对的退火温度为57℃，延伸时间为130s。

表1 ABAT基因检测引物对

实施例2

本实施例提供的检测ABAT基因的引物组包含了实施例1提供的引物组合外，还包括用于扩增ABAT基因组序列片段的第1344位－1529位区段的第四引物对。第四引物对的序列如表1所示。

本实施例提供第四引物对的使用方法，具体如下：

采用实施例1提供的方法制备细胞样品

1取细胞样品(50-100mg)加血清至1mL，加入等体积的PBS缓冲液，混匀后12000rpm离心5min，弃上清；

2加入667μL的STE，24μL的20％的SDS，37℃水浴1h，加10μL的20mg/mL的蛋白酶K混匀，55℃水浴消化过夜；

3消化的样品加入等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，12000rpm离心10min，取上清加入等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，12000rpm离心10min；

4取上清加入等体积的氯仿：异戊醇，漩涡震荡，再12000rpm离心10min，重复一次；

5取上清液加入2倍体积的冰醋酸，1/10体积醋酸钠水平摇动，直到可见絮状DNA析出，-20℃处理30min或冰浴15～20min，取出后再次12000rpm离心10min，使DNA沉淀；

6用70％的乙醇洗涤2次。晾干，加入TE缓冲液溶解，-20℃保存备用。

ABAT基因的基因组序列的扩增

本实施例获得DNA样品用重亚硫酸盐处理，获得的DNA样品为模板0.5μL，PCR反应Mix反应液10μL，引物对0.5μL/0.5μL，ddH₂O8.5μL，混合均匀；

反应程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s(延伸时间)，72℃延伸2min，35个循环。得到扩增产物。

实施例3

本实施例提供的检测ABAT基因的引物组包含了实施例1和实施例2提供的引物组合外，还包括用于扩增ABAT基因组序列片段第5006位－5403位区段的第五引物对。第五引物对的序列如表1所示。第五引物对的退火温度65℃，延伸30s。

本实施例提供的第五引物对的具体使用方法，参考实施例2提供的使用方法。

实施例4

本实施例提供一种检测ABAT基因的试剂盒，该试剂盒包括实施例1提供的引物组合。该试剂盒可用于检测ABAT基因编码序列，可以检测胎儿的ABAT基因是否正常和完整。且本实施例提供的试剂盒具有良好的灵敏性和特异性，使检测结果更为准确。

当然，在其他本实施例中，本发明提供的检测ABAT基因的试剂盒，还可以包括由Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg²⁺和溴酚蓝构成的PCR反应缓冲液、ddH₂O和200μL的PCR反应管中的一种或多种。

试剂盒的片段扩增方法参考实施例2的处理方法。

实施例5

本实施例提供一种检测ABAT基因的试剂盒，该试剂盒包括实施例1和实施例2提供的引物组合。该试剂盒可用于检测ABAT基因编码序列，可以检测胎儿的ABAT基因是否正常和完整，以及ABAT基因的基因组片段序列是否有甲基化现象发生。且本实施例提供的试剂盒具有良好的灵敏性和特异性，使检测结果更为准确。

当然，在其他本实施例中，本发明提供的检测ABAT基因的试剂盒，还可以包括由高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg²⁺和溴酚蓝构成的PCR反应缓冲液、ddH2O和200μL的PCR反应管中的一种或多种。

试剂盒的中第一至第三引物对的使用方法参考实施例1的使用方法；第四引物对的使用方法参考实施例2的处理方法。

实施例6

本实施例提供一种检测ABAT基因的试剂盒，该试剂盒包括实施例1、实施例2和实施例3提供的引物组合。该试剂盒可用于检测ABAT基因编码序列，可以检测胎儿的ABAT基因是否正常和完整，以及ABAT基因的基因组片段序列是否有甲基化现象发生。且本实施例提供的试剂盒具有良好的灵敏性和特异性，使检测结果更为准确。

当然，在其他本实施例中，本发明提供的检测ABAT基因的试剂盒，还可以包括由高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg²⁺和溴酚蓝构成的PCR反应缓冲液、ddH₂O、200μL的PCR反应管和重亚硫酸盐中的一种或多种。

试剂盒的中第一至第三引物对的使用方法参考实施例1的使用方法；第四引物对的使用方法参考实施例2的处理方法。扩增加过通过基因测序可以获得精确的结果。

实验例

荀某，26岁，怀孕14周。进行了胎儿产前检查，包括ABAT基因的检测。

检测原理：

羊水穿刺，是提取羊水中胎儿的脱落细胞，提取羊水中胎儿脱落细胞DNA等遗传信息，对胎儿进行检查。

本实验例采用实施例6提供的试剂盒进行胎儿ABAT基因的产前检测。

第一至第三引物对的PCR扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段大小正确，如图1到图3所示，图中M表示DNA的Marker，图中数字1-3表示三个平行试验；图1中目的片段长度1202bp，图2中目的片段1501bp，图3中目的片段2013bp；且第一至第三引物对扩增产物经测序无碱基突变。第四和第五引物对的PCR扩增反应产物经测序无甲基化位点。基于以上结果，可以判断出荀某的胎儿ABAT基因表达正常，出现相应疾病的可能性基本排除。

综上所述，本发明实施例的检测ABAT基因的引物组合、检测ABAT基因甲基化的引物组合以及检测ABAT基因的试剂盒能准确的检测ABAT基因的转录、甲基化等，节约时间。结果正确可靠。帮助孕妇家庭控制风险。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛松良基因科技有限公司

<120> 一种检测ABAT基因的引物组合、试剂盒及应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4412

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gtgatcaccc tcattacctc ttctgggccc cctgtggacc tgcgttgacc cagcatgggc 60

tacaatgggg gagttgggta atcgctcccg ttgcatcctg tttctgtctg aaaacccttg 120

tctttctgaa tccatctttc agtctctcac attctgtctt tcccctcctc cttcaccttc 180

cctccgtccc tctcccttgc gcacttgccg ggtaccagct gagtgcatcc ttttcccaaa 240

cctgctctgc ttccaagggg cccttttctg tctcctccac ctgtccccat gttttgggga 300

ctgcctggaa atccgggaca ccctcctgag gagggagctg gtgcccaacg gcacctctta 360

ggatgaaccc agccagctgc gttcctggcc tctgcagaat ggcatacaga aggcatttta 420

agcaagcgag ctgagctcgc cgcaggactc cgactaccag gcaccggtgg cagcacgcaa 480

agggtgtccc tgtccctcaa ggggtcatgg cctccatgtt gctcgcccag cgcctggcct 540

gcagcttcca gcacagctac cgcctgctgg tgcctggatc cagacacatt agtcaagctg 600

cagccaaagt cgacgttgaa tttgattatg atgggcctct gatgaagacg gaagtcccag 660

ggcctagatc tcaggagtta atgaaacagc tgaatataat tcagaatgca gaggctgtgc 720

attttttctg caattacgaa gagagccgag gcaattacct ggttgatgtg gacggcaacc 780

gaatgctgga tctttattcc cagatctcct ctgtccccat aggttacagc caccccgccc 840

tgctgaaact catccaacag cctcaaaatg cgagcatgtt tgtcaacaga cccgccctcg 900

gaatcctgcc tccggagaac tttgtggaga agctccggca gtccttgctc tcggtggctc 960

ccaaagggat gtcccagctc atcaccatgg cctgcggctc ctgctccaat gaaaacgcct 1020

taaagaccat cttcatgtgg taccggagca aggaaagagg gcagaggggc ttctcccagg 1080

aggagctgga gacgtgcatg attaaccagg cccctggctg ccccgactac agcatcctct 1140

ccttcatggg cgcgttccat gggaggacca tgggttgctt agcgaccacg cactctaaag 1200

ccattcacaa gatcgacatc ccttcctttg actggcccat cgcaccgttc ccacggctga 1260

aataccctct ggaagagttt gtgaaagaga accaacagga ggaggcccgc tgtctggaag 1320

aggtggagga tctgattgtg aaatatcgga aaaagaagaa gacggtggcc gggatcatcg 1380

tggagcccat ccagtccgag ggtggagaca accacgcatc cgatgacttc tttcggaagc 1440

tgagagacat cgccaggaag catggctgcg ccttcttggt ggacgaggtc cagaccggag 1500

gaggctgcac gggcaagttc tgggcccatg agcactgggg cctggatgac ccagcagacg 1560

tgatgacctt cagcaagaag atgatgactg ggggcttctt ccacaaggag gagttcaggc 1620

ctaatgctcc ctaccggatc ttcaacacct ggctggggga cccgtccaag aacctgttgc 1680

tggctgaggt catcaacatc atcaagcggg aggacctgct aaataatgca gcccatgccg 1740

ggaaggccct gctcacagga ctgctggacc tccaggcccg gtacccccag ttcatcagca 1800

gggtgagagg acgaggcacc ttttgctcct tcgatactcc cgatgattcc atacggaata 1860

agctcatttt aattgccaga aacaaaggtg tggtgttggg tggctgtggt gacaaatcca 1920

ttcgtttccg tcccacgctg gtcttcaggg atcaccacgc tcacctgttc ctcaatattt 1980

tcagtgacat cttagcagac ttcaagtaaa gaagccattt ccactacagt gagaaagccc 2040

ggatcccaac agttgtcaaa ttgattagtt tgcctaattc atgttttcac ttaaaagtat 2100

cagaggtgaa tgcacagtga agggtgattt gtggggaggg agcatttttg gtggtcttgg 2160

gggaggggag gggagggaag ggctggtgtt gattttcctc cctgcagagc caatggtgca 2220

cattggttta agcccagaga tcctgcttga gccctggact catcttggga agggccatgg 2280

gaggtcctgg ctagagttct gcccaacctt gaccaacccc agcaattttt ccaaaagcca 2340

gtcaagggca ttacatttgt tcctgggact ggcagctggg cctcctgggt gccagtccat 2400

ctcaagtgcc atattctgtg atcacggatg ttggctcccc ctcgccctat gcaagcaaac 2460

acactctcac ctcctctccc agcctcccgg agctctgagc acgccccacg catggtgcag 2520

gagggactgg acagatctga ggaaggccgt aaaatgggga caggaggatt cagctcagga 2580

gtaagggaag aggtcctctg gccccctgaa gatgagaatc acccctctca gtgcacctgg 2640

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gtggccttac ccgtgattct tactcggcat cctccattcc ccaaactccc tcctccctgt 2760

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tggatttctt ctggagggaa gcaccatgaa ttaaaggtgc cagagctcca tgcatggaaa 3120

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cctgagatga ctgagtatgg agattaccag gcagatgata ccgaaatgct taaaggggct 3240

gtggctgagg ctgtagcatc tctgctggag gtgagacact ctgggaactg atttgacctc 3300

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tctgagaaag cctggcttgt attatctgtc caaaaggaag cctcttcatc tcccggtgcc 3420

ttggttgact attttggaaa taggcatatc aaggttcctg attcagcact ttgctctttt 3480

aataacaaat cgtccaaaga tctcaaagta agggtttttt tttttagctt ccactcttcc 3540

gcagacttgg tcatcgacct atttttgttg aagaatgaaa ggcaatgaca agtttaacat 3600

atacaaattc gtgaattctt gttcattttg cattcctgca gtcagtgcta atccgtcgtt 3660

cttaatcagg agttctgcca ggtttaaggt cacctgcact cccagccaag tggtgatgta 3720

tgcctcccac tctctgcaag gttttcctca tttttatatt catttattca tcattcattc 3780

attcacctaa ctttcattaa atagctgcac catcccaggc cctgtgcgga gcatcgggaa 3840

tacaaagatg agataaaaca ttgtccctgc ccccgggggc tcacatgcca ctggaaacaa 3900

cagactctta aactaacaat tcaagcaggc gccaagtgct atgacagagg tgtgaataaa 3960

agcatcagga aatcggatgg agaaccacca ttcacccaag ggtcagagga ggtttcaaag 4020

aaaaggtgtc attggagcag tgttttgcag aatgagccag agttcaccaa gcaggcaagg 4080

caaggaaggg tgttgcagag agggaacagc atatgcaaag gcgtatcagt tcatggcatc 4140

acatctttca ctggggaagc cagtttccac aggcagcatc ccaaggttca ataaggcctt 4200

atttaacaag caagcaaaat gcaaaccaaa ccattattca tttattggct taagtatgct 4260

ttctcctgaa aactttagca ttgggtgcaa atattcagta tggttctcgg agtccaaagg 4320

gttttaagcc agggcacaac cagaaaagtg gctctctttg gtagggagag gggctccaat 4380

atttcgttct ctccccatgg ggcactgaca ga 4412

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

atctcaagtg ccatattctg tg 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

tctgtcagtg ccccatgggg 20

<210> 8

<211> 8994

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

atggcctcca tgttgctcgc ccagcgcctg gcctgcagct tccagcacag ctaccgcctg 60

ctggtgcctg gtaagccccg ggggtcttga taagaactgg tactaatgga agataccatc 120

cagactaggg attcctgggc tggaagagcc cttggggata aagggaccag ccagtgagtg 180

tttctgggac tgtcccactg tattagtctg ttctcatgct gctaataaag gtacacctga 240

gactgggtat tttatgaaga aaaagaggtt taatggtctc acagtttcat atggctgggg 300

aggcctcaca atcatggcgg aaggtgaagg aggaacaaag gcacgtctta catggctaca 360

ggcaagagag catgtgcagg ggaactcccg tttgtaaaaa catcagatcg tgtgagactt 420

actcaattga ctatcatgag aacagcatgg gaaagaccca cccccatgat tcaattacct 480

cccactgggt ccctcccatg acgtgggaat tatgggagct atgatttaag atgagatttg 540

aatgaggaca cagccaaacc acatcaccca ctatccataa aactgtcacc atcgccacct 600

cctttctctc tcccatctct gtcatatgat cctgtcccaa gtgcctcggt ctgatgggat 660

tggatccacc ctggagccac tctgcctgca ggtaggcggt ggcctccaca gccagatggc 720

cccaggccat ctctgcaggg accgctgggg aaaacacaca tctgggatcg ctgctaagga 780

acaaagaaag ccataagcga ctctgaaatt gacctagagc ccagctgtgc ttcagggtca 840

ctggatcact ggatgggagg caccatctta ggaatgtctc acccccactc tgccccacac 900

ccatggccac ttgcactggc tccttcttcc ttctgtttga cgtctttgag acctccctcc 960

caatagtccc atgagggagg gaggctcaag tgaatcctat tttacaggtg agagaactca 1020

ggcttagaga agcaaagcca tttgcccaag gtcacacagc cacttgcaag caactctgtc 1080

cggctccaat gctaactact cctccgtgtg cctccatgtg gctctggaga cagagccgcc 1140

agcaggagcc tcccttcaca tgccccgaga gtggcctcct gcagagatat aaagtgcctg 1200

gctcggggct ggccatgaaa taggttcaga aagaccagtg agcctccagc ctgtccccag 1260

ctctctcaca gcccctgtgc ttgtcatcat ggtgtccctt gttggcaggc cttactgcct 1320

tctgaagaca aactgctagc cgtgtccttg gtctgcatgt tgaatgctgg tgtgtatgtc 1380

ctgggtggca taaacagtag gagcgttcgc ccctccccaa ggagtatgag taggctttat 1440

tttaaaataa acatcttggc cgggcgcagt ggctcacaac tgtaatccca gcactttggg 1500

aggcgaggtg ggcagatcac ctgaggtcag gggtcgagac cagcctggcc aacatggtga 1560

aaccccgtct ctaccaaaaa tacaaaaatt agccaggtat ggtggtggat gcctgtaatc 1620

ccaactactc agcaggctga ggcaggagaa tcgcttgaat ccaggaggta gaggtggcag 1680

tgagctggat cgtgccactg tactccagcc tgggcaacat cgaggctctg tctcaaaaaa 1740

ataaaaaata aataaataaa catcttattt tttaaaaatt ttagatttac agagaagtta 1800

caaagatatt acagggagaa cccatatggc cctcaccagt ttcctccctt gttaacatct 1860

tacatcacca agatgcagtt gtcaacacta agaaactagc tggccaggcg cggtggctca 1920

cgcctataat gccagcactt tgggaggccg aggcaggagg atcatctgag gtcagaagtt 1980

cgagaccagc ctgggcaaca tggtgaaacc tcatctctac taaaaataca aaaaaaaaat 2040

tagccgggtg tggtggcagg cacctgtaat cccagctact tgggaggctg aggcagaaga 2100

agcacttgaa cccagaaggc ggaggttgca gtaagctgag attgagccac tgtacttcag 2160

cctgggcaac agactgagat taaaaaaaaa aaaaagaaag gaaaggaaga gaaggaagga 2220

aggaaggaag gaaggaagga aggaaggagg aaagaaagaa agaaagaaaa ggaaagaaag 2280

aaagaaggac agacagacaa gacagtggct cacagctgta accccagcaa tttgggaggc 2340

tgaggcagga ggatcgcttg agcccagggg tttgagacca gcctgggcaa catagggaga 2400

ccctgtctct gtgaaaaata caaaacttag ctgggcatgg tgacatgtgc ttgtagtctc 2460

agctactggg gaggctgaag cgggaggatt gcttgagcct gggagatcga ggctgcagtg 2520

agccatgatc atgccacagc actccagcct gggtggcctt gtcttaaaat aataataata 2580

gataaataag tttttaaaga cactaagaaa ctgaccttgg tatgttacca ttaaccaaac 2640

tccagacttt tatttggctt tcactcattt ttcctttaat gtctttttct gctccaggat 2700

ccaatccagg tacacacatt gcattgattt gtctcatctt ccatggcctc ctctggtctg 2760

tgacagtttc tcagtctttt ccttattctt ctcgacctgg gtggttttaa gaagttatca 2820

atggcttttg aggttttgct tttccttttt tcttttttgt ttttgttttt gtttttgttt 2880

ttgttttttt tttggtgtgt gtgtatgtgt gtctgagatg gagtctcact ctgttggcca 2940

ggctggagtg gtgccgtggt gcaatctcga ctcactgcaa cctccacctc ccggattcaa 3000

gtgatcctcc tgcctcagcc tcccaagtag ctgggattac aggcacctgc caccatgccc 3060

ggctaatttt tatatttttt gtagagacag ggttttacca tgttggccag gctagtctcc 3120

aactcctgac ctcaagtgat ccacccatct tggcctccca aagtgttagg attactggca 3180

tgagccactg cacctggcca aggttttgct ttatttattt atttataaga gaagcatatt 3240

aatgtttacc cataattatg ctaaactaaa tcagaaagat gtaggtatgg agggttccaa 3300

gtcagaaaga gagtctggca cagatgatcc attcattcca taactaaggc tgttgggcac 3360

ctactgcatg ccaagtgctg tgctgggtat taaggatgtg gcagtgaaga aagacatgtg 3420

gctcttgtgg agctctagcc tggtggcgca tgtggcacca tctttaaagg tcattctcca 3480

ggacatctga gctttcctaa ggagacacca tgggaagagc actaggtcaa gattcatgtg 3540

attggattgc taccttcacc acacattaac caagtgagcc taaccgatat accttatcca 3600

agcctcggtt ttctcatcag gaaaacgggt ctaataatca tatccttcct atttcacaaa 3660

tttcttgcat tagaagaaat ggttcatatg ggccaggcac agtggcccac acctgtaata 3720

ccaacacttt gggaggctga ggcgggtgga tcacctgagg tcaggagttc aggaccagcc 3780

tggccaacat gatgaaaccc cgtctctact aaaaatacaa aaattagctg cgcatggtgg 3840

tgtgcacctg taatcccagc tacttgggag gctgaggcag gagaatgggt tagaacccag 3900

gaggcggagg ttatggttca tgtgaaagca ctttatttgt atttacagta aggtgggaag 3960

tgtcctaact cccattttac aagcatggaa atacaggcac aatgcaaaaa acaaaaaaac 4020

agaaaaaata gaaatggcta aatcacagag tttcttacct ttacctcttc tgcattttct 4080

tggctggagc tgaatctttt ttggcacatt tatgatttag aaaaccatat ggtgagattt 4140

tgtcttctct tttgacttat tgatttggga tatctagtaa gccagaatat ggttttttaa 4200

gaatactaaa acacagtgtt ggcaaagata caggaatacg tgtactctcg tacactgcta 4260

ttaggcaagt agcaaccagg ggaaggatta aaaaatgata ggaattacag cttactttta 4320

acccatttag ccctcacctc cactccttaa ggtaaaggaa acttcaagtc agggaaatta 4380

agttgccaga gccacagagc tgatgagcgg ctgagccagg cttttgagct aagcccagtt 4440

ggctccagga cccgagccac tgtattgatt atctgccgcc acgtaacaca tacctccaga 4500

tttagcagat tgggatccta tgtttattat ctcacagttt ctgcgggttg ggactccagg 4560

ggtgacttag ccagatcctc tggctcaagg tctgtcatga gggtgtaatg gagctgtcag 4620

ctggggctgt ggtctcatat gatggctcaa cttggcggtt ggacgatcta ctggcagtcc 4680

cacttacggg gttgtggctg gattcagttc cttggatgct gtcagccaga agccactctc 4740

agttccttga tacgtggacc tcttcacaga gccgcttaca atgtggcaac tgctccctca 4800

aagcaagaga gggtgccaaa aatggaagcc tcagcctgca gccataccca cagcattttc 4860

ctgcttctcc atggtgtctc caccaggtcc ctgtgaggcc attaaagtga cgatagttaa 4920

cgatctgaca tggtgttccc aatggcatca ttttatgcct ccccaaaatt aataatctta 4980

tgttggtaaa tagaatacag agagtgggag accacatcaa aattgttatt gctgggtaga 5040

aaattaaatg tgttttcttt tttccatgtt gcttattggt atcttcctca ataaacattt 5100

tatcacaaaa taagtggggt ggacagttgc aggagcagat aaaaaaaatt ttttaacaga 5160

aaagcagagc aaacaactcc agttggactt gaccttcgtt ctggccaggc tcatgtacag 5220

agctttggct gtttgggaac acgacattcg tttatcactc tcggtctaaa gatcaagaga 5280

acattaacaa tgtttgctag ctactgtgta gtttggagct aaaaatagac tctggcttgg 5340

catggccatt gagggctgtg agccccagag ggccaggctg gatggaccat tcacatattg 5400

tgtctggtct tgtgtgtcaa taacatactc ttgccttctg gatgtgttat tttattcaag 5460

aatgaaaatg cttgatcatt cagtattaat tcaaaccggt tttttgcatc tttgtgatca 5520

tgatcaaaat ttgcctttag gagaagtgtg ttgttttgct gcaaatgttt cattcaaagg 5580

ctagcactcg atgaaatcaa agatagcctc agttccattc atagcttcta ggaaacaggt 5640

cagatgggca aatttcctgc taaccacttg ctagctgtgt gatcttgggc aaattaatta 5700

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gagtttgtga gaattaaatg agataagcca tgtaaattgc tccagatgat tcctggttgt 5820

taccctaagt gctcagtaca cacttgaatc tgcttctgtg tcttcataga tgagatccaa 5880

gagaaggttt acttgtccct tcaatttttg ttctgttctc ttgtggtgta ttgttatatg 5940

tcatcattaa gagaatattc attgtaatag tatttggtta ttttcctttt ttaaaaatgc 6000

caacattgag atatagaagg aaaagcagaa gtattgggat tgcaagaacc tgggttccaa 6060

tgctgactct tcaactcact agctgtgtga catcgggaaa gtcacttaac atctctgatc 6120

ctcaactgta aactgtgaac aacaatacta tctatatggt tgtatttaat tgtggattac 6180

ttaaaataga tggaagtttg cctaaatagg gccagcctag cattttagta aagactgaat 6240

atgtgttaat ttccccattc cccccctttc tgatagcgca gttgcaaaca aacttatgga 6300

aaacatgata ggagctgata cagttctcgg aacagaccca tctgccttgg acctgtcctc 6360

agcattcctg gcttgtgccc catagcgccc agttagccag ttctcaccct ttcttcacca 6420

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tgtcaagaca ctttctggag aaaagaaagg aggacgcgtg tgtcctcatt taagaacagc 6660

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cctgagctca ggagttccag accatcctgg gaaacatggc aaaacccctt ctctgccaaa 6960

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ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagtcatcga tatgttctag gacctttagc tctcttctaa 7320

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atgatgttac ataattaatt cagaaacctt ctttgataac caaagcaatt atggaaaatt 7500

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atattatgta atatatactt tagttttaat atataatata ttttagttgt aatatataat 7860

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aatatgttat atattttagt tataatatat attttagtta tatatgtagt tatataatat 7980

atatttttgt ttattatata tatgaagatg aaattagatt atttatgtaa tttatataaa 8040

gtgtccactg attccctagt ttggtacaat tatggcaacc ccagtaagag gaactaacat 8100

ttcccaacca ccaaatagta ccaggaaggt gaaagatcaa gagtaacact gaagggattt 8160

ctaggggttc ctgacagtaa accctcacac acttgtcttg gatacaccgc acctgtcttt 8220

cactcaggga tcagcaaggc ttgggcttga gctacccttt gtgtttcagc aacatgtgga 8280

gctaaaaaga ttgtgggatt cacccgggaa atcaaacacc ctctgtaaac tcattacaca 8340

ttatgtggaa aatgtgaaat gcattcaaac aaatgatggg tgaccatgta ttagtctgtt 8400

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cagcctctgc ctcctgggtt caagcgattc tcatgcctca gcctccctag tagctgggat 8760

tacaggtgcc tgccaccaca cccggctagt ttttatattt ttgatagaga cgggatttcg 8820

ccatgttggc caggctggtc ttgaactcct gacctcaggt gatccacctg cctgaacctc 8880

ccaaagtgct gggattatag gtatgagcca cggtgcccag ccagccacac acttttaaac 8940

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