鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法及应用与流程
本发明属于生物检测领域，尤其是鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法及应用。
背景技术：
番茄(Solanum lycopersicum)属于茄科茄属，是世界第一大蔬菜作物，起源于南美安第斯山脉，在16世纪左右被西班牙殖民者引入欧洲，经过几次强烈驯化和改良后成为现代栽培番茄。相较于其他性状，番茄果肉的颜色的驯化历程相对较短，几乎都是最近100年涌现出来的。现有栽培番茄的成熟果实颜色主要为红色、黄色和粉色，这是由于果实中富含番茄红素和类胡萝卜素等色素的原因。尽管番茄红素和类胡萝卜素都是对人体非常有益的天然色素，但这两类色素都属于脂溶性物质，必须通过正确的烹调或加工才能被人体良好吸收，对于食品结构单一的贫困人群发挥作用比较困难。因此，开发含有其他天然营养色素的番茄品种，是番茄育种工作的重要发展方向。
此前已经发现，某些野生种番茄，如S.chilense和S.cheesmaniae等，具有深蓝色的果实，富含花青素。研究表明，花青素作为强抗氧化剂，具有抗衰老、调节免疫力、抵抗突变等功效，且属于水溶性物质，鲜食即可吸收。因此，这些野生种番茄是开发新型番茄品种的重要种质资源。目前，美国俄勒冈州立大学利用野生蓝色番茄资源，育成紫色番茄OSU Blue等品种，以色列研究者也利用分子生物学技术，在番茄染色体上定位了一个控制花青素含量的显性基因座用于OSU Blue等品种的育种。2013年，江苏省农业科学院蔬菜研究所在国内首次自主育成紫黑色条纹果皮番茄，并命名为“金陵墨玉”，其成熟果皮性状与国外OSU Blue等品种存在显著差别，呈紫黑色条纹状。“金陵墨玉”花青素含量是普通栽培番茄的10倍以上，平均单果重30克，果实大小均匀，口感风味浓郁，高抗病毒病，耐叶霉病，具有很高的营养和经济价值。经过遗传分析，“金陵墨玉”的紫黑色果皮性状为隐性性状，并非由已知的Aft显性基因控制。因此，迫切需要开发与“金陵墨玉”紫黑色果皮性状连锁的新型分子标记，用于指导育种。
酶切扩增多态性序列，简称CAPS，是一种共显性分子标记，原理是根据己知位点的DNA序列设计特异性PCR引物，利用这些引物扩增该位点上的某一特定DNA片段，然后用某种限制性内切酶切割扩增产物，通过凝胶电泳分离酶切片段，观察其多态性。CAPS技术实质上是将PCR技术与限制性片段长度多态性，即RFLP技术相结合，因此又被称为PCR-RFLP。本发明采用CAPS标记方法进行“金陵墨玉”特异性状的标记及鉴别，通过人工设计的PCR引物，进而快速筛选、培育紫黑色条纹果皮番茄——“金陵墨玉”，对培育富含花青素番茄新品种具有重要的理论及实践意义。
技术实现要素：
为了快速鉴别、育种富含花青素的番茄——金陵墨玉，提供更高营养价值的新品种，本发明公开了鉴别番茄紫黑色果皮性状连锁的CAPS标记方法及应用，可应用于番茄品种改良分子辅助育种，在苗期即可进行初期筛选，大大缩短育种周期，其技术方案如下：
鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法，其特征在于：所述紫黑色条纹果皮番茄所携带的分子标记位于3号染色体行，序列为SEQ ID No.1的核苷酸碱基序列，所述紫黑色条纹果皮番茄基因组DNA模板经PCR扩增，其中紫黑色条纹果皮番茄的扩增引物为SEQ ID No.3-4的核苷酸碱基序列，所述SEQ ID No.3-4的核苷酸碱基序列为人工设计，所述扩增产物经限制性内酶酶切，所述限制性内切酶为NheI限制性内切酶，经酶切后可获得区别于其他番茄果皮颜色的特异谱带，所述紫黑色条纹果皮番茄特异性谱带为一条613bp。
进一步的，所述CAPS标记方法包括如下步骤：
(1)以紫黑色条纹果皮番茄为母本，绿色番茄为父本进行杂交，其中所述绿色番茄携带的分子标记序列为SEQ ID No.2的核苷酸碱基序列，两者杂交获得F1代，所述F1代果实发育到红熟期时果皮性状全为绿色；
(2)将上述步骤(1)中获得的F1代进行自交，获得F2代，所述F2果实发育到红熟期时果皮性状出现性状分离；
(3)采集亲本、F1代、F2代中成熟的果皮颜色不同的番茄植株叶片，使用CTAB法提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以合成的碱基序列SEQ ID No.3-4为引物，进行PCR扩增；
(4)提取将上述步骤(3)中的PCR扩增产物10μl，在1％琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果；确认无误后，使用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，保存于4℃备用。
(5)将上述步骤(4)中获得的不同个体基因组DNA的PCR扩增产物，分别使用Nhe I快速限制性内切酶进行酶切；
(6)将上述步骤(5)酶切后的产物在1％琼脂糖凝胶上检测酶切结果，所述凝胶电泳反应条件为85V/100mA电泳20分钟。
其中，所述纯合的紫黑色条纹果皮番茄母本DNA扩增产物无法被NheI酶切，表现为1条长度为613bp的条带，纯合的绿色父本DNA扩增产物完全被NheI酶切，表现为2条长度分别为390bp和223bp的条带；杂合的F1代仅有1条染色体DNA的扩增产物可以被NheI酶切，表现为3条长度分别为613、390和223bp的条带。
所述紫黑色条纹果皮番茄F2代为隐性纯合基因型，无法被NheI酶切，表现为1条长度为613bp的条带，绿色番茄的F2代为显性纯合或杂合，可以完全或部分被NheI酶切，表现为2条长度分别为390bp和223bp的条带，或3条长度分别为613、390和223bp的条带，橙色等过渡性状F2代也可能为杂合或隐性纯合，可以部分或完全被NheI酶切，表现为3条长度分别为613、390和223bp的条带，或2条长度分别为390bp和223bp的条带。
进一步的，所述PCR扩增体系总体积为50μl，其中：模板DNA 5μl，5U/μl Taq-Plus DNA聚合酶0.5μl，含Mg2+的10×PCR Buffer for Taq5μl，dNTPs mixture 4μl，10μM的正向引物和反向引物各1μl，ddH2O 33.5μl；所述PCR反应程序为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃再延伸5分钟。
进一步的，所述酶切反应体系为：底物DNA 10μl，10×CutOneTM Buffer 3μl，LightningTMNheI 1μl，ddH2O 16μl；酶切条件为37℃孵育15分钟，随即80℃孵育20分钟使限制酶失活，停止反应。
进一步的，所述分子标记方法在番茄品种改良以及育种中的应用。
本发明与现有技术相比，有如下优点：
本发明采用的CAPS分子标记方法，原理是根据己知位点的DNA序列设计特异性PCR引物，利用这些引物扩增该位点上的某一特定DNA片段，然后用某种限制性内切酶切割扩增产物，通过凝胶电泳分离酶切片段，观察其多态性。其优点是避免了传统RFLP分析中的转膜步骤，大大简化了操作，又能保持RFLP分析的精确度；而且很多限制性内切酶均可参与扩增DNA酶切，检测到多态性机会较大。本发明目的是获得与紫黑色番茄——金陵墨玉果皮颜色性状连锁的CAPS分子标记，进而快速筛选番茄的紫黑色表皮性状，应用于番茄品种改良分子辅助育种，在苗期即可进行初期筛选，大大缩短育种周期，对于培育富含花青素的番茄新品种具有重要的理论和实践意义。
附图说明
图1为本发明提供的CAPS标记在亲本紫黑色条纹果皮番茄、绿色番茄和杂交F1代中的酶切结果。
其中，M：DL2000DNA marker；1：亲本紫黑色条纹果皮番茄；2：亲本绿色番茄；3-5：杂交F1代。
图2为本发明提供的CAPS标记在F2代中的验证。
其中，M：DL2000DNA marker；1-5：紫黑色F2代；6-10：绿色F2代；11-16：橙色等其他颜色F2代。
图3为本发明提供的CAPS标记在自然群体中的应用。
其中，M：1kb DNA ladder；1-2：紫黑色番茄；3-9：其他颜色番茄。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明，如图1至图4所示：鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法，所述紫黑色条纹果皮番茄所携带的分子标记位于3号染色体上，序列为SEQ ID No.1的核苷酸碱基序列，所述紫黑色条纹果皮番茄基因组DNA模板经PCR扩增，其中紫黑色条纹果皮番茄的扩增引物为SEQ ID No.3-4的核苷酸碱基序列，所述SEQ ID No.3-4的核苷酸碱基序列为人工设计，所述扩增产物经限制性内酶酶切，所述限制性内切酶为NheI限制性内切酶，经酶切后可获得区别于其他番茄果皮颜色的特异谱带，所述紫黑色条纹果皮番茄特异性谱带为一条613bp。
优选地，所述CAPS标记方法包括如下步骤：
(1)以紫黑色条纹果皮番茄为母本，绿色番茄为父本进行杂交，其中所述绿色番茄携带的分子标记序列为SEQ ID No.2的核苷酸碱基序列，两者杂交获得F1代，所述F1代果实发育到红熟期时果皮性状全为绿色；
(2)将上述步骤(1)中获得的F1代进行自交，获得F2代，所述F2果实发育到红熟期时果皮性状出现性状分离；
(3)采集亲本、F1代、F2代中成熟的果皮颜色不同的番茄植株叶片，使用CTAB法提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以合成的碱基序列SEQ ID No.3-4为引物，进行PCR扩增；
(4)提取将上述步骤(3)中的PCR扩增产物10μl，在1％琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果；确认无误后，使用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，保存于4℃备用。
(5)将上述步骤(4)中获得的不同个体基因组DNA的PCR扩增产物，分别使用LightningTM Nhe I快速限制性内切酶进行酶切；
(6)将上述步骤(5)酶切后的产物在1％琼脂糖凝胶上检测酶切结果，所述凝胶电泳反应条件为85V/100mA电泳20分钟。
其中，所述纯合的紫黑色条纹果皮番茄母本DNA扩增产物无法被NheI酶切，表现为1条长度为613bp的条带，纯合的绿色父本DNA扩增产物完全被NheI酶切，表现为2条长度分别为390bp和223bp的条带；杂合的F1代仅有1条染色体DNA的扩增产物可以被NheI酶切，表现为3条长度分别为613、390和223bp的条带。
所述紫黑色条纹果皮番茄F2代为隐性纯合基因型，无法被NheI酶切，表现为1条长度为613bp的条带，绿色番茄的F2代为显性纯合或杂合，可以完全或部分被NheI酶切，表现为2条长度分别为390bp和223bp的条带，或3条长度分别为613、390和223bp的条带，橙色等过渡性状F2代也可能为杂合或隐性纯合，可以部分或完全被NheI酶切，表现为3条长度分别为613、390和223bp的条带，或2条长度分别为390bp和223bp的条带。
优选地，所述PCR扩增体系总体积为50μl，其中：模板DNA 5μl，5U/μl Taq-Plus DNA聚合酶0.5μl，含Mg2+的10×PCR Buffer for Taq5μl，dNTPs mixture 4μl，10μM的正向引物和反向引物各1μl，ddH2O 33.5μl；所述PCR反应程序为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃再延伸5分钟。
优选地，所述酶切反应体系为：底物DNA 10μl，10×CutOneTM Buffer 3μl，Lightning TMNheI 1μl，ddH2O 16μl；酶切条件为37℃孵育15分钟，随即80℃孵育20分钟使限制酶失活，停止反应。
优选地，所述分子标记方法在番茄品种改良以及育种中的应用。
一、实施例1
步骤一：供试材料
本试验所用的母本为紫黑色樱桃番茄“金陵墨玉”，父本为绿色番茄“JDLBS”，均来自于江苏省农业科学院蔬菜研究所。经过杂交组合获得F1代，然后自交获得F2分离群体。
步骤二：性状鉴定
待果实发育到红熟期，目测鉴定成熟果皮颜色性状。F1代全为绿色，F2代出现性状分离。
步骤三：CPAS分子标记的获取
采集亲本、F1、F2代中成熟但果皮颜色不同的番茄植株叶片，使用CTAB法提取基因组DNA。然后以提取的基因组DNA为模板，人工合成碱基序列为SEQ ID No.3-4作为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系总体积为50μl，其中：模板DNA 5μl，Taq-Plus DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，10X PCR Buffer for Taq(含Mg2+)5μl，dNTPs mixture(2.5mM each)4μl，10μM的正向引物和反向引物各1μl，ddH2O 33.5μl。PCR反应程序为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃再延伸5分钟。取10μl PCR产物，在1％琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果。确认无误后，使用胶回收试剂盒回收PCR产物，保存于4℃备用。
对不同个体基因组DNA的PCR产物，分别使用LightningTM Nhe I快速限制性内切酶进行酶切。酶切反应体系为：底物DNA 10μl，10X CutOneTM Buffer 3μl，LightningTM NheI 1μl，ddH2O 16μl。酶切条件为37℃孵育15分钟，随即80℃孵育20分钟使限制酶失活，停止反应。然后在1％琼脂糖凝胶上，85V/100mA电泳20分钟，检测酶切结果。
对于亲本和F1代，酶切结果如图1所示。纯合的紫黑色条纹果皮番茄“金陵墨玉”亲本DNA扩增产物无法被NheI酶切，表现为1条长度为613bp的条带。纯合的绿色亲本“JDLBS”DNA扩增产物完全被NheI酶切，表现为2条长度分别为390bp和223bp的条带。而杂合的F1代仅有1条染色体DNA的扩增产物可以被NheI酶切，表现为3条长度分别为613、390和223bp的条带。
对于F2代，酶切结果如图2所示。紫黑色条纹果皮番茄F2代为隐性纯合基因型，无法被NheI酶切，表现为1条长度为613bp的条带。绿色F2代为显性纯合或杂合，可以完全或部分被NheI酶切，表现为2条长度分别为390bp和223bp的条带，或3条长度分别为613bp、390bp和223bp的条带。橙色等过渡性状F2代也可能为杂合或隐性纯合，可以部分或完全被NheI酶切，表现为3条长度分别为613、390和223bp的条带，或2条长度分别为390bp和223bp的条带。
二、在自然群体中的验证
对江苏省农业科学院蔬菜研究所收集的9个番茄品种进行CAPS标记验证。采用与步骤三同样的方法，提取这些番茄叶片的DNA，进行PCR扩增后酶切鉴定，结果如图3所示。紫黑色条纹果皮番茄均表现为隐性纯合基因型，酶切结果为1条长度为613bp的条带。其他颜色表现为显性纯合或杂合基因型，可以完全或部分被NheI酶切，表现为2条长度分别为390bp和223bp的条带，或3条长度分别为613、390和223bp的条带。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法及应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 613
<212> DNA
<213> 番茄 (Solanum lycopersicum)
<400> 1
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<213> 番茄 (Solanum lycopersicum)
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<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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