鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法及应用与流程

文档序号:12412744阅读:来源:国知局

技术特征:

1.鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法,其特征在于:所述紫黑色条纹果皮番茄所携带的分子标记序列位于3号染色体上,为SEQ ID No.1的核苷酸碱基序列,所述紫黑色条纹果皮番茄基因组DNA模板经PCR扩增,其中紫黑色条纹果皮番茄的扩增引物为SEQ ID No.3-4的核苷酸碱基序列,所述SEQ ID No.3-4的核苷酸碱基序列为人工设计,所述扩增产物经限制性内酶酶切,所述限制性内切酶为NheI限制性内切酶,经酶切后可获得区别于其他番茄果皮颜色的特异谱带,所述紫黑色条纹果皮番茄特异性谱带为一条613bp。

2.根据权利要求1所述的鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法,其特征在于:所述CAPS标记方法包括如下步骤:

(1)以紫黑色条纹果皮番茄为母本,绿色番茄为父本进行杂交,其中所述绿色番茄携带的分子标记序列为SEQ ID No.2的核苷酸碱基序列,两者杂交获得F1代,所述F1代果实发育到红熟期时果皮性状全为绿色;

(2)将上述步骤(1)中获得的F1代进行自交,获得F2代,所述F2果实发育到红熟期时果皮性状出现性状分离;

(3)采集亲本、F1代、F2代中成熟的果皮颜色不同的番茄植株叶片,使用CTAB法提取基因组DNA,以提取的基因组DNA为模板,以人工合成的碱基序列SEQ ID No.3-4为引物,进行PCR扩增;

(4)提取将上述步骤(3)中的PCR扩增产物10μl,在1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果;确认无误后,使用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物,保存于4℃备用。

(5)将上述步骤(4)中获得的不同个体基因组DNA的PCR扩增产物,分别使用LightningTMNhe I快速限制性内切酶进行酶切;

(6)将上述步骤(5)酶切后的产物在1%琼脂糖凝胶上检测酶切结果,所述凝胶电泳反应条件为85V/100mA电泳20分钟。

其中,所述纯合的紫黑色条纹果皮番茄DNA扩增产物无法被NheI酶切,表现为1条长度为613bp的条带,纯合的绿色DNA扩增产物完全被NheI酶切,表现为2条长度分别为390bp和223bp的条带;杂合的F1代仅有1条染色体DNA的扩增产物可以被NheI酶切,表现为3条长度分别为613、390和223bp的条带。

所述紫黑色条纹果皮番茄F2代为隐性纯合基因型,无法被NheI酶切,表现为1条长度为613bp的条带,绿色番茄的F2代为显性纯合或杂合,可以完全或部分被NheI酶切,表现为2条长度分别为390bp和223bp的条带,或3条长度分别为613、390和223bp的条带,橙色等过渡性状F2代也可能为杂合或隐性纯合,可以部分或完全被NheI酶切,表现为3条长度分别为613、390和223bp的条带,或2条长度分别为390bp和223bp的条带。

3.根据权利要求1-2所述的鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法,其特征在于:所述PCR扩增体系总体积为50μl,其中:模板DNA 5μl,5U/μl Taq-Plus DNA聚合酶0.5μl,含Mg2+的10×PCR Buffer for Taq5μl,dNTPs mixture 4μl,10μM的正向引物和反向引物各1μl,ddH2O 33.5μl;所述PCR反应程序为:94℃预变性2分钟;94℃变性30秒,54℃退火30秒,72℃延伸1分钟,35个循环;72℃再延伸5分钟。

4.根据权利要求1-2所述的鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法,其特征在于:所述酶切反应体系为:底物DNA 10μl,10×CutOneTM Buffer 3μl,LightningTM NheI 1μl,ddH2O 16μl;酶切条件为37℃孵育15分钟,随即80℃孵育20分钟使限制酶失活,停止反应。

5.如权利要求1-2所述的鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法的应用,其特征在于:所述分子标记方法在番茄品种改良以及育种中的应用。

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