本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种与小麦千粒重和茎秆可溶性糖含量相关的分子标记TaSnRK2.3B及其应用。
背景技术：
小麦是世界上最主要粮食作物之一，其生产与人类粮食安全密切相关。干旱是影响小麦生产的最主要非生物限制因素。蛋白激酶是逆境信号传递网络的枢纽，在逆境胁迫应答反应中发挥着极其重要的作用。蔗糖非发酵蛋白激酶(sucrose non-fermental protein kinase,SnRK)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其中SnRK2参与多种逆境信号的转导，在植物抗逆、根系发育以及农作物产量形成等方面起关键作用。如何将SnRK2用于抗逆高产农作物新品种培育，不仅是分子生物学家和遗传学家关注的焦点，也是育种家迫切要解决的问题。从农作物种质资源中发掘SnRK2优异等位基因，然后通过传统杂交和分子标记辅助选择相结合加以利用，无疑是最直接、最有效，也是最易被接受的农作物品种改良方法。常规育种通常依赖表型选择，尽管取得很大成就，但耗时耗力，育种进程缓慢；相比较而言，分子标记辅助选择育种可以在早世代进行有针对性的选择，操作简单易行，且可以高效利用优异基因，能显著加快育种的进程。
小麦TaSnRK2.3B基因参与对多种逆境胁迫的应答，其过量表达能显著提高植物对多种逆境的抗性(Tian et al.Cloning and characterization of TaSnRK2.3B,a novel SnRK2 gene in common wheat.J Exp Bot.2013,64(7):2063-2080)，因此是小麦抗逆分子育种的优异基因资源，然而迄今为止，尚未开发出TaSnRK2.3B基因的分子标记，亦无从知晓分子标记与农艺性状的关系。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测小麦性状的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测小麦群体基因组的E位点和F位点的基因型，根据E位点和F位点的基因型确定待测小麦性状如下：
E位点的基因型为C/C且F位点的基因型为G/G的小麦群体千粒重大于E位点的基因型为T/T且F位点的基因型为C/C的小麦群体千粒重；
E位点的基因型为C/C且F位点的基因型为G/G的小麦群体千茎秆可溶性糖含量大于E位点的基因型为T/T且F位点的基因型为C/C的小麦群体茎秆可溶性糖含量；
和/或，E位点的基因型为C/C且F位点的基因型为G/G的小麦群体株高低于E位点的基因型为T/T且F位点的基因型为C/C的小麦群体株高；
所述E位点为序列表序列1自5′末端的第25位，位于小麦1B染色体上，标记wmc156和P3346-183之间，基因区第2154位(自5′末端始)；
所述F位点为序列表序列2自5′末端的第295位，位于1B染色体上，标记wmc156和P3346-183之间，基因区第2737位(自5′末端始)；。
上述方法中，所述检测待测小麦群体基因组的E位点和F位点的基因型的方法包括如下步骤：对待测小麦的基因组DNA中任意一段包括所述E位点在内的DNA片段进行PCR扩增，且对所述待测小麦的基因组DNA中任意一段包括所述F位点在内的DNA片段进行PCR扩增，并将2种PCR扩增产物依次进行酶切鉴定，得到所述包括E位点在内的DNA片段酶切产物X和所述包括E位点在内的DNA片段酶切产物Y，根据所述酶切产物X和酶切产物Y片段大小确定所述待测小麦群体基因组的E位点和F位点的基因型。
上述方法中，所述对待测小麦的基因组DNA中任意一段包括所述E位点在内的DNA片段进行PCR扩增的引物对由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成；
所述对所述待测小麦的基因组DNA中任意一段包括所述F位点在内的DNA片段进行PCR扩增的引物对由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成；
所述包括所述E位点在内的DNA片段的酶切所用的酶为N1aⅢ；
所述包括所述F位点在内的DNA片段的酶切所用的酶为AvaⅡ。
上述方法中，所述根据所述酶切产物X和酶切产物Y片段大小确定所述待测小麦群体基因组的E位点和F位点的基因型为如下：
若所述酶切产物X仅为299bp的DNA片段，则所述待测小麦在E位点的基因型为CC；
若所述酶切产物X为26bp、273bp的DNA片段，则所述待测小麦在E位点的基因型为TT；
若所述酶切产物Y仅为324bp的DNA片段，则所述待测小麦在F位点的基因型为CC；
若所述酶切产物Y为295bp、29bp的DNA片段，则所述待测小麦在F位点的基因型为GG。
本发明另一个目的是提供一种检测待测小麦群体基因组的E位点和F位点的基因型的方法。
本发明提供的方法，包括上述中检测待测小麦群体基因组的E位点和F位点的基因型的方法。
本发明第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测小麦性状的产品。
本发明提供的产品，为检测待测小麦群体基因组的E位点和F位点的基因型的物质。
上述产品中，所述物质包括引物对1、引物对2、N1aⅢ酶和AvaⅡ酶；
所述引物对1由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物2由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成。
上述产品中，所述产品为试剂盒。
上述检测待测小麦群体基因组的E位点和F位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测小麦性状中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述检测待测小麦群体基因组的E位点和F位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测小麦性状产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述方法在培育株高低、茎秆可溶性糖含量和/或千粒重高的小麦中的应用也是本发明保护的范围。
本发明第四个目的是提供一种筛选或培育千粒重高、茎秆可溶性糖含量高和/或株高低的小麦群体的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：筛选或培育上述的E位点的基因型为C/C且F位点的基因型为G/G的小麦群体。
所述PCR扩增的目标序列为序列表序列1自5′末端第1-299bp和序列2自5′末端第1-324bp。
本发明的实验证明，本发明通过对小麦多态性群体中TaSnRK2.3B基因的变异分析，共发现10处多态性位点。本发明选取代表性的E位点开发CAPS标记，命名为BM1。本发明还选取代表性的F位点开发dCAPS标记，命名为BM2。这两个SNP在自然群体中主要存在两种单体型：单体型甲(C、G)和单体型乙(T、C)。关联分析表明，这两种单体型的纯合类型中，单体型甲的千粒重、茎秆可溶性糖含量显著(或极显著)高于单体型乙，单体型甲的株高极显著低于单体型乙。实验证明，通过检测所述的两个SNP，即可找到千粒重和茎秆可溶性糖含量相对较高、株高相对较矮的小麦。本发明为小麦分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产矮杆小麦品种或研究中具有重要意义。
附图说明
图1为根据本发明两个SNP开发分子标记酶切产物电泳检测结果。
其中，泳道M为100bp DNA ladder。左图为用N1aⅢ对不同小麦的PCR产物进行酶切的带型；右图为用AvaⅡ对不同小麦的PCR产物进行酶切的带型。左图中的泳道C含有一条299bp的条带；左图中的泳道T含有两条从上至下依次为273bp和26bp的条带，由于电泳时间较长，26bp的小片段条带基本看不见。右图中的泳道C含有一条324bp的条带；右图中的泳道G含有两条从上至下依次为295bp和29bp的条带，由于电泳时间较长，29bp的小片段条带基本看不见。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1、与小麦千粒重、茎秆可溶性糖含量和株高相关的2个SNP及其标记多态性检测
1、扩增含小麦2个SNP的基因组DNA片段的特异引物
发明人从表1中32份普通六倍体小麦品种(来自于国家种质资源库)发现了变异位点，从中选择代表性的2个SNP开发为分子标记，分别对应于序列表序列1自5′末端的第25位(命名为E位点，存在C和T的多态性)，和序列表序列2自5′末端的第295位(命名为F位点，存在G和C的多态性)；这两个位点E和F在小麦自然变异群体中主要存在两种单体型：
单体型甲：C、G；
单体型乙：T、C。
表1、32份普通六倍体小麦品种
根据小麦不同基因组的序列差异，设计基因组特异性引物对PE扩增包含E位点在内的DNA片段，设计特异性引物对PF扩增包含F位点在内的DNA片段。引物对PE由名称为pe1和pe2的单链DNA组成，pe1为序列3(5′-AACTCTGATCTGAACACGAATGCA-3′)所示的单链DNA，pe2为序列4(5′-GTGATCCTCTTCAGAGTTTCAGACAC-3′)所示的单链DNA。
引物对PF由名称为pf1和pf2的单链DNA组成，pf1为序列5(5′-AAGGCAGAAAACTTTGAATCATAAC-3′)所示的单链DNA，pf2为序列6(5′-TCCTCATCGCTCTGCAGCTCGGCCAGGTC-3′)所示的单链DNA。
2、序列多态性检测及基因分型方法的建立
1)提取待测小麦的基因组DNA，用基因组特异引物(F和R)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
F:5′-TAAGTACCGCTTATGACAATCTGT-3′(序列7)；
R:5′-CAGTAATAATGTACACAGCGATAG-3′(序列8)。
2)以步骤1)的PCR扩增产物稀释50倍为模板，采用步骤1中的引物对PE进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A；采用步骤1中的引物对PF进行PCR扩增，得到PCR扩增产物B。
PCR扩增A的体系为：模板DNA 2μL(10pg-1μg)、2×Utaq PCR MasterMix12.5μL、引物pe1(10μmol/L)和pe2(10μmol/L)各1.0μL，补ddH2O至25.0μL。
PCR扩增B的体系为：模板DNA 2μL(10pg-1μg)、2×Utaq PCR MasterMix12.5μL、引物pf1(10μmol/L)和pf2(10μmol/L)各1.0μL，补ddH2O至25.0μL。
PCR扩增条件为:95℃5min,95℃50s,59℃45s,72℃50s,33次循环；72℃10min，4℃保存。
3)将步骤2)的PCR产物A用N1aⅢ酶切，获得酶切产物X；将步骤2)的PCR产物B用AvaⅡ酶切，获得酶切产物Y；酶切产物均进行4％琼脂糖凝胶电泳检测，识别记录酶切产物中各片段大小，并根据如下方法判断并记录待测小麦在所述E和F位点的情况：
若所述酶切产物X为299bp(序列1第1位-第299位)的DNA片段，则所述待测小麦在所述E位点为C纯合(表示为C/C)的小麦(图1左图中的泳道C)；
若所述酶切产物X为273bp(序列1的第27位-第299位)、26bp(序列1的第1位-第26位)的DNA片段，则所述待测小麦在所述E位点为T纯合(表示为T/T)的小麦(图1左图中的泳道T)；
若所述酶切产物Y为324bp(序列2的第1位-第324位)的DNA片段，则所述待测小麦在所述F位点为C纯合(表示为C/C)的小麦(图1右图中的泳道C)；
若所述酶切产物Y为295bp(序列2的第1位-第295位)、29bp(序列2的第296位-第324位)的DNA片段，则所述待测小麦在所述F位点为G纯合(表示为G/G)的小麦(图1右图中的泳道G)。
4)根据步骤3)的结果，将小麦分为在所述E和F位点的情况为如下Ⅰ-Ⅱ种类型：
Ⅰ:C/C和G/G(即单体型甲纯合)；
Ⅱ:T/T和C/C(即单体型乙纯合)。
上述“/”前为一条同源染色体上的情况，上述“/”后为另一条同源染色体上的情况。
3、利用两个分子标记对自然群体进行分型并与千粒重、、茎秆可溶性糖含量和株高性状进行关联分析
以262份普通六倍体小麦(来自于国家种质资源库)组成的自然群体中各小麦分别作为待测小麦按照步骤2的方法进行分型，随机对部分小麦的扩增产物大小进行测序验证，结果如表2所示。
表2、小麦自然群体中E和F位点的情况统计
注：“-”表示无PCR产物。
用Tassel2.1软件中的General linear model(GLM)模型对两种单倍型和千粒重、株高性状进行关联分析。
结果发现，单体型Ⅰ的千粒重和茎秆可溶性糖含量均显著高于单体型Ⅱ，单体型Ⅰ的株高极显著低于单体型Ⅱ。对自然群体的研究表明，提高千粒重、提高茎秆可溶性糖含量和降低株高的优异基因型。
表3、小麦自然群体中两种基因型相关性状统计结果
上述茎秆可溶性糖含量采用近红外反射光谱分析仪测得，具体方法见文献(Wang et al.Development of near-infrared reflectance spectroscopy models for quantitative determination of water-soluble carbohydrate content in wheat stem and glume.Anal Lett.44(15),2478-2490)
注：小写和大写字母分别代表不同基因型小麦之间性状差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。
序列表
<110>中国农业科学院作物科学研究所
<120>一种与小麦千粒重和茎秆可溶性糖含量相关的分子标记TaSnRK2.3B及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 299
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
aactctgatc tgaacacgaa tgcaygtctt gtgacacttg acagagaatc cttggcgtgc 60
aatactccat tccggactac gtcagggtgt cttccgactg cagacgcctc ctgtcccaaa 120
tattcactgc cgatccttca aaggtactac tactgcttat cctctctttt tttctgttta 180
ttagtaactt ccaaggaaac ttcagattgc tccaaaaggc agaaaacttt gaatcataac 240
ttgaatggtg cctaaccaaa agtgatttga atcgtgtctg aaactctgaa gaggatcac 299
<210> 2
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
aaggcagaaa actttgaatc ataacttgaa tggtgcctaa ccaaaagtga tttgaatcgt 60
gtctgaaact ctgaagagga tcacgatcgc tgagatcaag aagctgccgt ggtacctgaa 120
gagcctgccc aaggagatcg cggagaggga cagggccaac ttcaaggagc ccgagacgga 180
ggcggagacc gcggcggcgg cggcgcagcc cgtggaggag atcatgcgga tcatccagga 240
ggccaaggcc cccggcgaca tgtccaagtc gtcggccgac gcggcgctgc tcgcsgagct 300
ggccgagctg cagagcgatg agga 324
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
aactctgatc tgaacacgaa tgca 24
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gtgatcctct tcagagtttc agacac 26
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
aaggcagaaa actttgaatc ataac 25
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
tcctcatcgc tctgcagctc ggccaggtc 29