一种用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物的制作方法

本发明属于微流控技术领域，特别是涉及一种用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物。

背景技术：

乳化作用是指第一种液体分散到第二种不相溶的液体中去的过程。乳化液滴常见的是油包水、水包油等。油包水(W/O)液滴是水以小液滴的形式分散于油中。乳化体系包含油相、水相和表面活性剂组成。水相是内相或分散相，油是外相或分散介质，表面活性剂一般是由非极性、亲油的碳氢链部分和极性、亲水的基团共同构成，具有又亲水又亲油的双重性质。表面活性剂的加入，对于液滴的形成和稳定性至关重要，可以大大降低油/水界面的张力，并在界面吸附形成界面膜，从而在一定程度上保证了液滴的稳定性。但是，从热力学观点来说，液滴只是相对的、暂时的体系，液滴的不稳定性主要体现在液滴的沉降、聚集和融合。目前主要通过调整油相、水相和表面活性剂的配比，降低界面张力，增大界面膜强度，提高液滴的稳定性。液滴生成的方式有多种，其中基于微流控芯片的液滴生成技术最近几年得到快速发展，广泛应用于生物界和材料界，是一种非常重要的技术。其原理主要是通过两相液流之间一定角度户型挤压作用下，其中一相连续液流断裂形成液滴。目前常用的液滴制备方式有正交结构(T-junction)和流式聚焦(Flow-focusing)等。生成的液滴水相可以包含细胞或分子。可以进行细胞的筛选、培养，单细胞基因组扩增测序；可以进行单分子PCR反应分析、单分子酶联免疫分析、药物合成等。

数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量方法，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统定量PCR不同，数字PCR通过直接计数的方法，可以实现起始DNA模板的绝对定量。

微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)将样品进行微滴化处理，形成几万个纳升级液滴，每个液滴或不含待检核酸靶分子，或含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对微滴进行检测，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。目前比较常用的油相为氟化油，如FC-40、FC-7500，配用的表面活性剂有：PFPE-PEG-PFPE、1,1,2,2-四氢全氟癸醇等。一方面氟化油易挥发，易溶解气体在加热时会产生大量气泡，另一方面氟化油相关的一些表面活性剂价格比较昂贵，增加了制备液滴成本。

现有一种微流控芯片可以将生成的液滴单层均匀平铺在一定的位置上，进而对每个液滴进行检测和分析。微滴式数字芯片构体是具有产生微滴颗粒复杂结构的，是用来生成和储存微液滴颗粒的载体，在微滴式数字芯片构体内首先要注入油相成分溶液，而油相成分溶液是用来生成微滴颗粒必备条件，(这就是水相试剂在油相溶液中，由于表面张力的作用而形成的一个独立的油包水颗粒)也是为微液滴颗粒生存提供环境，同时也为微液滴颗粒进行扩增时需要提供温度的热传导介质。因此需要有一种液滴制备的油相组合物，使生成的液滴大小均一，热稳定性好，不易挥发，不易产生气泡，不抑制PCR扩增。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供了一种用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物。使用该油相组合物制备的液滴大小均匀稳定，PCR扩增前后液滴不易挥发，不产生气泡，不融合，且对PCR扩增无抑制作用。

一种用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物，包括主体成分和表面活性剂，所述主体成分为矿物油和烷烃，所述表面活性剂为EM90和TritonX-100。

其中，所述烷烃为12～16烷中的一种或混合。

目前液滴制备时常用的为氟化油，如FC-40、FC-7500，配用的表面活性剂有：PFPE-PEG-PFPE、1,1,2,2-四氢全氟癸醇等。一方面氟化油易挥发，易溶解气体在加热时会产生大量气泡，另一方面氟化油相关的一些表面活性剂价格比较昂贵，增加了制备液滴成本。而矿物油具有非极性不溶于水、不易挥发、性质稳定、对PCR扩增无抑制作用、轻质油运动粘度(cps)较低等优点，常被用于对PCR反应液进行液封等。矿物油(又名石蜡油)，是石油所得精炼液态烃的混合物，为饱和的环烷烃与链烷烃混合物。所以本发明选择使用矿物油作为主体成分的基础。

优选的，所述烷烃为十四烷。进一步优选的，所述烷烃为正十四烷。

由于单独使用矿物油作为油相的主体成分运动粘度仍然偏高，液滴形成和沉降速度偏低，所以还需要添加其他成分解决这个问题。所以又加入了具有较为合适的粘度的物质来降低油相的粘度。经过实验，发现烷烃类，特别是正十四烷，具有良好的效果，能够形成较好的液滴，且液滴经PCR扩增等步骤后，仍具有良好的形态，不易破碎或融合。

优选的，所述烷烃的体积占所述主体成分质量的10-50％。进一步优选的，所述烷烃的质量占所述主体成分质量的30％-40％。实验发现，所述烷烃添加的量有一定的限度，添加量过高的话，所得的液滴也容易破碎或发生融合。

优选的，所述表面活性剂中，EM90的质量为主体成分的1％～3％，TritonX-100的质量为主体成分的1％～3％。进一步优选的，所述表面活性剂中，EM90的质量为主体成分的2％～3％，TritonX-100的质量为主体成分的2％～3％。更进一步优选的，所述表面活性剂中，EM90的体质量为主体成分的3％，TritonX-100的质量为主体成分的3％。在表面活性剂的选择上，需有优异的高温稳定性，与其它活性成分有良好的相容性。表面活性剂EM90属硅酮表面活性剂，硅氧烷链上接聚氧乙烯醚链，以PEG作为亲水基，聚硅氧烷作为亲油基。表面活性剂TritonX-100是一种非离子型表面活性剂，在溶液中不是以离子状态存在，所以稳定性高，与其他类型表面活性剂能混合使用，相容性好，在各种溶剂中均有良好的溶解性。

本发明用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物使用矿物油替代氟化油，具有非极性不溶于水、不易挥发、性质稳定、对PCR扩增无抑制作用、轻质油运动粘度较低等优点，同时，通过添加合适的烷烃来进一步降低运动粘度，再添加合适的表面活性剂EM90和TritonX-100，最终，使用本发明油相组合物来制备液滴，所得液滴具有大小均一、热稳定性好、不易产生气泡、不易挥发、不抑制扩增等优点。

附图说明

图1为实施例3中组合物(1)、(3)中形成的液滴图；

图2为实施例3中组合物(2)、(4)中形成的液滴图；

图3为实施例4中组合物(4)～(8)中形成的液滴图；

图4为实施例4中组合物(4)～(8)中形成的液滴荧光信号检测图；

图5为实施例5中各组合物形成的液滴图，其中图(1)～(7)分别为组合物(1)～(7)中形成的液滴图。

具体实施方式

实施例1

目前液滴制备时常用的为氟化油，如FC-40、FC-7500，配用的表面活性剂有：PFPE-PEG-PFPE、1,1,2,2-四氢全氟癸醇等。一方面氟化油易挥发，易溶解气体在加热时会产生大量气泡，另一方面氟化油相关的一些表面活性剂价格比较昂贵，增加了制备液滴成本。而矿物油具有非极性不溶于水、不易挥发、性质稳定、对PCR扩增无抑制作用、轻质油运动粘度(cps)较低等优点，常被用于对PCR反应液进行液封等。所以本发明选择使用矿物油作为主体成分的基础。但是单独使用矿物油作为油相的主体成分运动粘度仍然偏高，液滴形成和沉降速度偏低，所以还需要添加其他成分解决这个问题。

首先要考虑油相组合物的主体成分之间的相互溶解性，故设计了以下几种油相组合物(均以质量计)：

(1)1/2矿物油+1/2二甲基硅油

(2)1/2矿物油+1/2正十四烷

(3)1/2矿物油+1/2DEC

(4)1/3矿物油+1/3二甲基硅油+1/3正十四烷

(5)1/3矿物油+1/3二甲基硅油+1/3DEC

结果：组合物(1)、(4)和(5)中的两种或三种油不互溶。

实施例2

根据实施例1的实验结果，进一步对油相组合物加入不同的表面活性剂，根据不同表面活性剂和油相主体成分的溶解性，设计以下几种油相组合物(均以质量计)：

(1)1/2矿物油+1/2正十四烷+3％EM90

(2)1/2矿物油+1/2DEC+3％EM90

(3)1/2矿物油+1/2正十四烷+3％TritonX-100

(4)1/2矿物油+1/2DEC+3％TritonX-100

(5)1/2矿物油+1/2正十四烷+3％EQ503

(6)1/2矿物油+1/2DEC+3％EQ503

各油相组合物中，矿物油和正十四烷的比例是指占主体成分的质量比例，而表面活性剂的比例为各自质量与主体成分的比值。

结果：油相组合物(5)和(6)中的表面活性剂与油相不相溶，其余能够较好相溶。

实施例3

使用实施例2筛选到的(1)～(4)组油相组合物进行液滴制备实验，并进行PCR扩增。具体流程如下：

(1)按上述(1)～(4)方案配制油相。

(2)配制水相即PCR反应体系。

模板来自非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株H1975，同时有T790M和L858R两种突变。

引物序列为：

F：5’-GCCTGCTGGGCATCTG-3’；

R：5’-TCTTTGTGTTCCCGGACATAGAC-3’

探针序列为：

5’-FAM-ATGAGCTGCATGATGAG-MGB-NFQ-3’，其中FAM为荧光报告基团，NFQ为荧光淬灭基团。

水相配方：

(3)将油相平铺在微滴发生装置内。

(4)采用阶梯乳化的方式用注射泵将水相加入到油相中同时形成液滴。

(5)生成好的微滴按如下程序进行PCR扩增：

96℃预变性10min；98℃变性30s，62℃退火延伸1min，共39个循环；62℃延伸1min，25℃保温。

(6)扩增结束，显微镜观察液滴形态。若液滴均一稳定，阅读仪检测荧光信号。

结果：PCR扩增后，实施例2中组合物(1)、(3)中形成的液滴大小不均一，不太稳定(图1)；实施例2中组合物(2)、(4)中的液滴破碎(图2)，DEC稳定性太差。

实施例4

用矿物油-正十四烷混合物作为油相主体成分，EM90和TritonX-100分别作为表面活性剂，虽能与水相形成微滴，但大小不均一、易融合，可以结合使用以降低界面张力，提高液滴稳定性。故设计了以下几种油相组合物并进行液滴制备和扩增：

(1)1/2矿物油+1/2正十四烷+1％EM90+3％TritonX-100

(2)1/2矿物油+1/2正十四烷+2％EM90+3％TritonX-100

(3)1/2矿物油+1/2正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100

(4)2/3矿物油+1/3正十四烷+1％EM90+3％TritonX-100

(5)2/3矿物油+1/3正十四烷+2％EM90+3％TritonX-100

(6)2/3矿物油+1/3正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100

(7)2/3矿物油+1/3正十四烷+3％EM90+2％TritonX-100

(8)2/3矿物油+1/3正十四烷+3％EM90+1％TritonX-100

各组合物中，矿物油和正十四烷的比例是指占主体成分的质量比例，而EM90和TritonX-100的比例为各自质量与主体成分的比值。

液滴制备方法、水相配方及数字PCR实验步骤与实施例3中相同。

结果：组合物(1)～(3)制备的液滴不太稳定，易破碎，正十四烷所加的量过多，此外组合物(3)制备的液滴从破碎和融合的数量上看优于组合物(1)和(2)。

组合物(4)～(8)制备的液滴比较均一(图3)，液滴直径在80μm左右。PCR扩增后比较稳定，无明显融合，仪器可检测到较强荧光信号(图4)。

实施例5

确定油相组合物的成分为使用矿物油和正十四烷为主体成分，使用EM90和TritonX-100混合作为表面活性剂之后，继续对矿物油与正十四烷的添加比例进行进一步优化筛选。

(1)30％矿物油+70％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100

(2)40％矿物油+60％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100

(3)50％矿物油+50％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100

(4)60％矿物油+40％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100

(5)70％矿物油+30％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100

(6)80％矿物油+20％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100

(7)90％矿物油+10％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100

各组合物中，矿物油和正十四烷的比例是指占主体成分的质量比例，而EM90和TritonX-100的比例为各自质量与主体成分的比值。

液滴制备方法、水相配方及数字PCR实验步骤与实施例3中相同。

结果：组合物(1)中边缘区域有大量破碎液滴，整体有部分融合液滴；组合物(2)中破碎液滴减少，但融合液滴仍较多；组合物(3)中基本无破碎液滴，有少量融合液滴；组合物(4)～(7)中基本没有破碎和融合液滴(图5)。

实施例6

确定油相组合物的成分为使用矿物油和正十四烷为主体成分，使用EM90和TritonX-100混合作为表面活性剂，以及各成分的用量之后，对正十四烷的潜在替代成分进行进一步筛选。

(1)2/3矿物油+1/3正十二烷+3％EM90+3％TritonX-100

(2)2/3矿物油+1/3正十三烷+3％EM90+3％TritonX-100

(3)2/3矿物油+1/3正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100

(4)2/3矿物油+1/3正十五烷+3％EM90+3％TritonX-100

(5)2/3矿物油+1/3正十六烷+3％EM90+3％TritonX-100

各组合物中，矿物油和烷烃的比例是指占主体成分的质量比例，而EM90和TritonX-100的比例为各自质量与主体成分的比值。

液滴制备方法、水相配方及数字PCR实验步骤与实施例3中相同。

结果：各组合物中所得结果较为接近，均能获得较好的液滴，基本没有破碎和融合的液滴。