基于颜色判定的环介导等温扩增（LAMP）技术检测栗疫霉黑水病菌的制作方法

本发明涉及一种检测栗疫霉黑水病菌(Phytophthora lateralis Tucker et Mibrath)的LAMP引物，以及利用所述引物检测栗疫霉黑水病菌的分子检测方法，属于生物技术领域。

背景技术：

栗疫霉黑水病菌是一用于种重要的毁灭性植物病原菌，可引起严重的栗树黑水病及多种果树的根、茎腐烂病^[1]。由于该病害为害重、传播快，而防治根除又极为困难，该病原菌已引起欧盟等许多国家的高度重视，纷纷采取措施严防其传入。近年来，由于国际间苗木及其植物包装材料的调运日趋频繁，该病原菌极可能传入我国，一旦传入，将对我国农林业、生态环境等造成重大威胁。由于我国未有栗疫霉黑水病菌发生的报道，国家质检总局于2007年将该病菌列入新修订的《进境植物检疫性有害生物名录》中。为了防止该病原菌传入我国，需要对其进行快速、准确地检测，因此针对栗疫霉黑水病菌的检测我们进行了一系列的研究。

栗疫霉黑水病菌[Phytophthora cambivora(Petri)Buisman]隶属藻菌界(Chromista)，卵菌门(Oomycota)，霜霉目(Peronosporales)，腐霉科(Pythiaceae)，疫霉属(Phytophthora)，是一类重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范围均很广泛。病菌菌丝体珊瑚状，在利马豆培养基上产生菌丝膨大体。孢子囊宽卵形、亚球形、倒梨形或椭圆形，孢子囊无乳突，基部钝圆。孢子囊大小48～83×32～61μm，平均59～64×40～45μm；长宽比1.4～1.8。孢子囊内层出，孢囊梗单生，不分枝或合轴生。异宗配合。藏卵器球形，大部分藏卵器的外壁有疣状隆起，直径30～58μm，平均40.5±5.5μm，藏卵器壁的厚度平均为2μm。卵孢子满器，直径35～39μm，平均33.8±5.6μm。雄器侧生，通常延长，单细胞或双细胞，大约60％的雄器是双细胞。雄器长度16.6～29.4μm，平均27.3μm(双细胞型)、19.3μm(单细胞型)。病菌最低生长温度2℃,最适生长温度22～24℃，最高生长温度32℃^[1]。

传统病原菌的分类、鉴定主要基于形态学特性、致病性测定等，操作繁琐，耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰^[2]，此外，也有应用血清学方法检测栗疫霉黑水病菌的报道^[2]，但是检测时间较长，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术^[3]，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60～70min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生^[4]。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。

靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。目前，分子检测常用的靶标基因有核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed space,ITS)，然而许多学者认为该靶标没有足够的变异位点区分所有的疫霉种^[5]。本发明选用的新型靶标三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1)是一个与原癌基因Ras(Rat sarcoma)相关的基因，在酵母中，该基因编码一个与Ras相关的GTP结合蛋白。Ypt1基因包含有多个内含子，非编码区具有足够多的特异性位点，并且其序列在种内高度保守，非常适合作为疫霉菌的分子检测靶标^[6]。

参考文献

1.Erwin,D.C.；Ribeiro,O.K.Phytophthora lateralis.In:Phytophthora diseases worldwide.American Phytopathological Society,St.Paul(US),1996,pp 365-367.

2.Daniells J,Davis D,Peterson R,et al..Goldfinger:not as resistant to sigatoka/yellow sigatoka as first thought.Infomusa，1995,4(1):6.

3.Notomi,T.,Okayama,H.,Masubuchi,H.,Yonekawa,T.,Watanabe,K.,Amino,N.,and Hase,T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research,2000,28:e63-e63.

4.6.Yasuyoshi Mori,Kentaro Nagamine,Norihiro Tomita,and Tsugunori Notomi.Detection of Loop-Mediated Isothermal Amplification Reaction by Turbidity Derived from Magnesium Pyrophosphate Formation.Biochemical and Biophysical Research Communications,2001,289:e150-e154.

5.White,T.J.,Bruns,T.,Lee,S.,and Taylor,J.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.1990,Pages 315-322in:PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications.M.A.Innis,D.H.Gelfand,J.J.Sninsky,and T.J.White,eds.Academic Press,San Diego,CA.

6.Chen Y,Roxby R.Characterization of a Phytophthora infestans gene involved in vesicle transport.Gene,1996,181(1-2):89-94.

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是解决现有技术中栗疫霉黑水病菌的检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差及PCR检测技术需要热循环仪器，成本高，无法快速检测栗疫霉黑水病菌的问题，从而提供了栗疫霉黑水病菌新的分子检测方法，对栗疫霉黑水病菌进行LAMP检测，该方法检测周期短(仅需80min)、特异性强、灵敏度高、可肉眼观察检测结果且不需昂贵仪器成本低、操作简便易行。

新型靶标基因的选取和引物的筛选是LAMP检测的关键因素。目前，分子检测广泛应用的是基于核糖体转录间隔区(ITS)的靶标，但由于ITS序列没有足够的变异位点区分所有的疫霉种，因此需要发掘出新的分子检测靶标。首先，查找相关文献选取了tRNA(转运RNA)EF1α(翻译延长因子)、Ypt1(三磷酸鸟苷结合蛋白基因)、beta微管蛋白基因等可用性靶标，然后依次筛选靶标基因，最终选择Ypt1作为检测栗疫霉黑水病菌的靶标基因。再对以该靶标基因设计的多套引物进行试验和验证，选出一套检测栗疫霉黑水病菌的LAMP引物。

本发明提供的技术方案是：

本发明选取新型靶标基因，设计和筛选用于检测栗疫霉黑水病菌的LAMP引物，其包括四条特异性引物F3、B3、FIP、BIP和两条环引物LF和LB，引物序列分别如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示，具体见下表1。

表1栗疫霉黑水病菌LAMP引物序列

同时，本发明还提共一种利用上述引物检测栗疫霉黑水病菌的方法，其过程是：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行LAMP扩增反应，反应后，在常光下肉眼观察，以羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)的颜色变化进行结果判定；常光下，天蓝色表示检测结果为阳性(+)，即样品中检测到栗疫霉黑水病菌，紫色表示检测结果为阴性(-)，即样品中未检测到栗疫霉黑水病菌(图1)。

上述检测栗疫霉黑水病菌的方法，其LAMP反应体系为：2.5μL 10×ThermoPol Buffer(0.1％Trion-X,20mM Tris-HCl,10mM KCl，10mM(NH4)SO4,pH 8.8)，4μL MgSO4(50mM)，4μL甜菜碱(5M)，3.5μL dNTPs(10mM)，内引物FIP和BIP(20μM)各2μL，外引物F3和B3(10μM)各0.5μL，环引物LF和LB(10μM)各1μL，2μL HNB(2.4mM)，1μL Bst DNA聚合酶(8U·μL-1)，模板DNA 2μL。

上述检测栗疫霉黑水病菌的方法，其LAMP反应程序为：62℃，80min。

有益效果

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)实用性好。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有剧毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过HNB的颜色变化便可直接判断结果，整个操作过程简单易行，适用于对栗疫霉黑水病菌的口岸检疫和病害的快速诊断。

(2)恒温扩增。不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源LAMP反应就可以发生，极大的扩展了LAMP使用的范围，LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。

(3)准确性高。由于传统栗疫霉黑水病菌检测技术只是根据形态特征来进行鉴定，耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰；而本发明根据栗疫霉黑水病菌的Ypt1序列，该序列在栗疫霉黑水病菌中的基因组中非常保守，利用Bioedit软件将栗疫霉黑水病菌的Ypt1序列和其他疫霉菌的Ypt1序列进行比较，设计栗疫霉黑水病菌特异性的LAMP引物。LAMP反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于普通PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都比较高。

本发明的检测体系在62℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到栗疫霉黑水病菌，且不需要复杂仪器，为栗疫霉黑水病菌的检测提供了新的技术平台，能较好满足对栗疫霉黑水病菌的现场检测，适用于出入境植物和植物产品的检验检疫中栗疫霉黑水病菌的高灵敏度、快速检测，同时可用于栗疫霉黑水病的调查、快速诊断和监测等，对防止栗疫霉黑水病菌传入我国具有重要意义，同时，本发明体系的建立也为其他病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。

附图说明

图1 LAMP反应加入HNB显色反应试验，其中，-:阴性反应呈现紫色；+:阳性反应呈现天蓝色。

图2栗疫霉黑水病菌Ypt1基因核酸序列及引物位置。

图3引物的通用性验证；

其中1:P.cambivora(ATCC 38811)；2:P.cambivora(CBS 111329)；3:P.cambivora(CBS 114093)；4:阴性对照。

图4引物的种间特异性验证；

其中1:栗疫霉黑水病菌P.cambivora,2-4:雪松疫霉根腐病菌P.lateralis,5,6:栎树猝死病菌P.ramorum,7:大豆疫霉P.sojae,8:致病疫霉P.infestans,9:大雄疫霉P.megasperma,10:瓜类疫霉P.melonis,11:辣椒疫霉P.capsici,12:苜蓿疫霉P.medicaginis,13:掘氏疫霉P.drechsleri,14:棕榈疫霉P.palmivora,15:荔枝霜疫霉Peronophthora litchi,16:恶疫霉P.cactorum,17:苎麻疫霉P.boehmeriae,18:隐地疫霉P.cryptogea,19:烟草疫霉P.nicotianae,20:阴性对照。

图5引物的属间特异性验证；

其中1:栗疫霉黑水病菌P.cambivora；2:禾谷镰孢菌Fusarium graminearum；3:尖镰孢菌F.oxysporum；4:层出镰孢菌F.proliferatum；5:木贼镰孢菌F.equiseti；6:茄腐镰孢菌F.solani；7:燕麦镰孢菌F.avenaceum；8:黄色镰孢菌F.culmorum；9:平头炭疽菌Colletotrichum truncatum；10:胶孢炭疽菌C.gloeosporioides；11:多主棒孢菌Corynespora cassiicola；12:大豆炭腐病菌Macrophomina phaseolina；13:大豆紫斑病菌Cercospora kikuchii；14:立枯丝核菌Rhizoctonia solani；15:冬青丽赤壳菌Calonectria ilicicola；16:玉蜀黍平脐蠕孢菌Bipolaris maydis；17:米曲霉菌Aspergillus oryzae；18:稻瘟病菌Magnaporthe grisea；19:大豆南方茎溃疡病菌Diaporthe phaseolorum var.meridionalis；20:大豆北方茎溃疡病菌Diaporthe phaseolorum var.caulivora；21:大豆茎褐腐病菌Phialophora gregata；22:大豆拟茎点种腐病菌Phomopsis longicolla；23:大豆锈菌Phakopsora pachyrhiz；24:阴性对照。

图6栗疫霉黑水病菌LAMP检测方法的灵敏度检测；

其中1-8:100ng·μL^-1、10ng·μL^-1、1ng·μL^-1、100pg·μL^-1、10pg·μL^-1、1pg·μL^-1、100fg·μL^-1、10fg·μL^-1浓度梯度的栗黑水疫霉菌DNA作为反应模板；10:阴性对照。

具体实施方式

实施例1：选取新型靶标基因，设计和筛选用于检测栗疫霉黑水病菌的LAMP引物，并建立LAMP检测体系

(一)新型靶标基因的选取及引物的设计和筛选

新型靶标基因的选取和引物的筛选是LAMP检测的关键因素。目前，分子检测广泛应用的是基于核糖体转录间隔区(ITS)的靶标，但由于ITS序列没有足够的变异位点区分所有的疫霉种，因此需要发掘出新的分子检测靶标。首先，查找相关文献选取了tRNA(转运RNA)EF1α(翻译延长因子)、Ypt1(三磷酸鸟苷结合蛋白基因)、beta微管蛋白基因等可用性靶标。以靶标Ypt1为例，从GeneBank中下载栗疫霉黑水病菌的Ypt1基因序列和其它疫霉种的Ypt1基因序列，然后应用Bioedit软件对所有下载的Ypt1基因序列进行对比分析，并使用PrimerExplore V4软件在线设计引物，根据引物长度、引物自由能及GC含量等选取合适的引物进行实验，从中筛选种内通用性好，种间特异性强，属间特异性强，灵敏度高的引物。依次筛选其他靶标，最终选择Ypt1作为检测栗疫霉黑水病菌的靶标基因(图2)。再对以该靶标基设计的多套引物进行多次试验和验证，选出一套通用性好，特异性强，灵敏度高，能快速，准确检测出栗疫霉黑水病菌的引物，序列如下：

检测引物对((F3、B3、FIP、BIP、LB))

F3(正向外引物)：CCTAGGTCCACCATGGCTA(SEQ ID NO.1)；

B3(反向外引物)：CGTGTCCCACTACAATTCCG(SEQ ID NO.2)；

FIP(正向内引物)(F1C+F2)：

TCCAGCTCGATCGTGCGAATTT-TTGACCTCCAGGCTGACG(SEQ ID NO.3)；

BIP(反向内引物)(B1C+B2)：

CGGCAAGACCATCAAGCTCCA-CCAGTTAGCTCCATGAAGCA(SEQ ID NO.4)；

LF(正向环引物)：GCACAACAACGAGCACGATAA(SEQ ID NO.5)；

LB(反向环引物)：GATTGTGCGTGCATTCCCG(SEQ ID NO.6)。

(二)建立栗疫霉黑水病菌LAMP检测体系

栗疫霉黑水病菌LAMP反应体系：2.5μL 10×ThermoPol Buffer(0.1％Trion-X,20mM Tris-HCl,10mM KCl，10mM(NH4)SO4,pH 8.8)，4μL MgSO4(50mM)，4μL甜菜碱(5M)，3.5μL dNTPs(10mM)，内引物FIP和BIP(20μM)各2μL，外引物F3和B3(10μM)各0.5μL，环引物LF和LB(10μM)各1μL，2μL HNB(2.4mM)，1μL Bst DNA聚合酶(8U·μL^-1)，2μL模板DNA。将上述混合物置于0.2mL的PCR反应管内并在涡旋器上轻微涡旋，然后离心以确保管壁上没有液滴。将反应管置于62℃在水浴锅中等温反应80min。

实施例2：制备DNA模板

提取样品的DNA作为LAMP反应的模板，具体过程如下：

(一)菌株培养及菌丝粉制备

将供试疫霉菌菌株转至LBA(利马豆培养基(郑小波.疫霉菌及其研究技术.中国农业出版社.1997))平板上，其它菌株转至PDA(马铃薯葡萄糖固体培养基(Erwin,D.C.；Ribeiro,O.K.Phytophthora lateralis.In:Phytophthora diseases worldwide.American Phytopathological Society,St.Paul(US),1996,pp 365-367))平板上，25℃黑暗培养3d后从菌落边缘切取10块2×2mm菌丝块，疫霉菌的菌株转至V8液体培养基(郑小波.疫霉菌及其研究技术.中国农业出版社.1997)，其它菌株转至PDB(马铃薯葡萄糖液体培养基)中，25℃振荡培养5～7d，过滤收集菌丝，经冷冻抽干研磨成菌丝粉，-20℃保存备用。

(二)基因组DNA的提取

取少量菌丝粉，加900μL 2％CTAB提取液和90μL 10％SDS，漩涡混匀，于60℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm·min^-1离心10min，取上清液加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm·min^-1离心10min；将上清液转移至新管中，加入等体积的氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm·min^-1离心5min。取上清液转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol·L^-1NaAc(pH 5.2)，-20℃静置沉淀(>1h)。12000rpm·min^-1离心10min，倾去上清液，沉淀用70％乙醇洗涤2次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20μg·ml^-1RNase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。

实施例3：检测LAMP引物的特异性和灵敏度

(一)特异性检测

本发明所用菌株及相关信息见表2。采用本发明所设计的引物对表2中所有供试菌株的基因组DNA进行LAMP扩增反应，HNB的显色反应结果显示不同来源的栗疫霉黑水病菌反应管均呈天蓝色，为阳性结果，阴性对照反应管没有变色，仍为紫色(图3)。栗疫霉黑水病菌的反应管均呈天蓝色，为阳性结果，其他疫霉菌、真菌和阴性对照的反应管均呈紫色，为阴性结果(图4，5)，结果表明该引物具有很好的特异性，可以将栗疫霉黑水病菌与其近似种及其他相关种区分开。

表2供试菌株及LAMP检测结果

注：NJAU表示南京农业大学；CAIQ表示中国检科院；*表示无菌株(仅提供菌株的DNA)+表示发生了LAMP扩增；‐表示无扩增。

(二)灵敏度检测

在26μL的反应体系中测定了上述所建立的检测体系的灵敏度，将10倍梯度稀释的栗疫霉黑水病菌的基因组DNA(从100ng·μL^-1到10fg·μL^-1)为模板进行LAMP扩增，于62℃等温条件下反应80min。图6显示了灵敏度检测结果的HNB可视化显色图，发生LAMP扩增时，阳性反应变为天蓝色，未发生LAMP扩增的仍为紫色。检测结果显示最低检测灵敏度为100pg·μL^-1。

<110> 中华人民共和国昆山出入境检验检疫局

<120> 基于颜色判定的环介导等温扩增（LAMP）技术检测栗疫霉黑水病菌

<160> 6

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<400> 1

CCTAGGTCCACCATGGCTA 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<400> 2

CGTGTCCCACTACAATTCCG 20

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<400> 3

TCCAGCTCGATCGTGCGAATTT-TTGACCTCCAGGCTGACG 40

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<400> 4

CGGCAAGACCATCAAGCTCCA-CCAGTTAGCTCCATGAAGCA 41

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<400> 5

GCACAACAACGAGCACGATAA 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<400> 6

GATTGTGCGTGCATTCCCG 19