本发明涉及一种检测方法，具体是一种志贺氏菌含量检测方法。
背景技术：
志贺氏菌属（Shigella）细菌通称痢疾杆菌，在引发我国感染性腹泻病的各原菌所占比例中居首位，是一类具有高度感染性和危害严重的革兰氏阴性肠道致病菌。每年全球有1.6亿人因此菌感染患病，约有110万人死亡，绝大多数为5岁以下儿童。由于生活污水中含有许多病原微生物，例如来自肠道的细菌、病毒、原生动物、寄生虫等，这些微生物绝大部分都将随污水处理进入剩余污泥，在污泥的农业土地利用过程中，通过污染地表水、地下水、形成气溶胶等多种途径而扩散到环境中。这些随污泥进入环境中的病原微生物对人体健康和环境安全造成了巨大的潜在威胁，因此，准确快速地检测污泥中的志贺氏菌，对防止志贺氏菌传播扩散具有十分重要的意义。志贺氏菌的检测通常采用食品卫生微生物学检验国家标准（GB4789.5–2003），即利用鉴别培养基结合生理生化鉴定。但这种方法应用于污泥样品检测时，一方面由于污泥组成复杂、含有大量微生物而对检测的灵敏度产生干扰，另一方面存在检测周期长、漏检率高、程序复杂、所需试剂繁多等缺点。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种志贺氏菌含量检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种志贺氏菌含量检测方法，包括如下步骤：（1）取含志贺氏菌的待检样品，提取基因组DNA：称取3g待检样品到盛有27mLGN增菌液的50mL的离心管中，涡旋震荡5-10min，混合均匀得混合物；取0.5mLGN增菌液稀释混匀的混合物加入到经过灭菌的4.5mLGN增菌液中得到各个稀释梯度，设5-7个稀释度；采用三管或者五管平行法，每个稀释度设3-5个重复样，于37℃培养18-24h，直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养，称之为菌液；（2）选择性增菌培养：移取步骤（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志贺氏菌增菌肉汤中，37℃培养18-24h；（3）DNA提取：移取步骤（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL离心管中，10000g离心3min，弃去上清液；再加入1mL无菌PBS缓冲液，轻轻吹打均匀，10000g离心3min，弃去上清液；加入10μL超纯水，液氮冷冻和沸水浴反复冻融3次，然后10000g离心3min取上清液，完成DNA提取；提取后的DNA短时间内4℃保存，长时间-20℃保存；（4）建立志贺氏菌的实时荧光单引物等温扩增25μL反应体系：RNA/DNA组合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用灭菌DEPC水补足体系；所述SYBERGreenⅡ为300倍稀释；将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上58℃反应40min，反应过程中实时监测荧光信号；（5）检测分析：分析检测数据。
作为本发明进一步的方案：所述引物选用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成为RNA序列，3’端12nt合成为DNA序列；Blocker选用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修饰，中间随机加上五个XNA修饰。
作为本发明进一步的方案：所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六种堿基中的一种。
作为本发明再进一步的方案：步骤（1）所述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或水洗法结合商业化试剂盒法。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明方法能克服传统的微生物培养检测方法存在的检测周期长、步骤繁琐、费时费力等缺点，使检测时间大大缩短到2-3天，操作步骤和劳动强度也大为缩减，达到省时省力、快速灵敏的要求。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中，一种志贺氏菌含量检测方法，包括如下步骤：（1）取含志贺氏菌的待检样品，提取基因组DNA：称取3g待检样品到盛有27mLGN增菌液的50mL的离心管中，涡旋震荡5-10min，混合均匀得混合物；取0.5mLGN增菌液稀释混匀的混合物加入到经过灭菌的4.5mLGN增菌液中得到各个稀释梯度，设5-7个稀释度；采用三管或者五管平行法，每个稀释度设3-5个重复样，于37℃培养18-24h，直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养，称之为菌液；（2）选择性增菌培养：移取步骤（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志贺氏菌增菌肉汤中，37℃培养18-24h；（3）DNA提取：移取步骤（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL离心管中，10000g离心3min，弃去上清液；再加入1mL无菌PBS缓冲液，轻轻吹打均匀，10000g离心3min，弃去上清液；加入10μL超纯水，液氮冷冻和沸水浴反复冻融3次，然后10000g离心3min取上清液，完成DNA提取；提取后的DNA短时间内4℃保存，长时间-20℃保存；（4）建立志贺氏菌的实时荧光单引物等温扩增25μL反应体系：RNA/DNA组合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用灭菌DEPC水补足体系；所述SYBERGreenⅡ为300倍稀释；将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上58℃反应40min，反应过程中实时监测荧光信号；（5）检测分析：分析检测数据。所述引物选用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成为RNA序列，3’端12nt合成为DNA序列；Blocker选用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修饰，中间随机加上五个XNA修饰。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六种堿基中的一种。步骤（1）所述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或水洗法结合商业化试剂盒法。
实施例1：
本发明志贺氏菌含量检测方法，包括如下步骤：（1）取含志贺氏菌的待检样品，提取基因组DNA：称取3g待检样品到盛有27mLGN增菌液的50mL的离心管中，涡旋震荡5min，混合均匀得混合物；取0.5mLGN增菌液稀释混匀的混合物加入到经过灭菌的4.5mLGN增菌液中得到各个稀释梯度，设5-7个稀释度；采用三管或者五管平行法，每个稀释度设3个重复样，于37℃培养18-24h，直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养，称之为菌液；（2）选择性增菌培养：移取步骤（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志贺氏菌增菌肉汤中，37℃培养18h；（3）DNA提取：移取步骤（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL离心管中，10000g离心3min，弃去上清液；再加入1mL无菌PBS缓冲液，轻轻吹打均匀，10000g离心3min，弃去上清液；加入10μL超纯水，液氮冷冻和沸水浴反复冻融3次，然后10000g离心3min取上清液，完成DNA提取；提取后的DNA短时间内4℃保存，长时间-20℃保存；（4）建立志贺氏菌的实时荧光单引物等温扩增25μL反应体系：RNA/DNA组合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用灭菌DEPC水补足体系；所述SYBERGreenⅡ为300倍稀释；将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上58℃反应40min，反应过程中实时监测荧光信号；（5）检测分析：分析检测数据。所述引物选用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成为RNA序列，3’端12nt合成为DNA序列；Blocker选用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修饰，中间随机加上五个XNA修饰。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六种堿基中的一种。步骤（1）所述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或水洗法结合商业化试剂盒法。
实施例2：
本发明志贺氏菌含量检测方法，包括如下步骤：（1）取含志贺氏菌的待检样品，提取基因组DNA：称取3g待检样品到盛有27mLGN增菌液的50mL的离心管中，涡旋震荡10min，混合均匀得混合物；取0.5mLGN增菌液稀释混匀的混合物加入到经过灭菌的4.5mLGN增菌液中得到各个稀释梯度，设7个稀释度；采用三管或者五管平行法，每个稀释度设5个重复样，于37℃培养24h，直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养，称之为菌液；（2）选择性增菌培养：移取步骤（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志贺氏菌增菌肉汤中，37℃培养24h；（3）DNA提取：移取步骤（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL离心管中，10000g离心3min，弃去上清液；再加入1mL无菌PBS缓冲液，轻轻吹打均匀，10000g离心3min，弃去上清液；加入10μL超纯水，液氮冷冻和沸水浴反复冻融3次，然后10000g离心3min取上清液，完成DNA提取；提取后的DNA短时间内4℃保存，长时间-20℃保存；（4）建立志贺氏菌的实时荧光单引物等温扩增25μL反应体系：RNA/DNA组合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用灭菌DEPC水补足体系；所述SYBERGreenⅡ为300倍稀释；将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上58℃反应40min，反应过程中实时监测荧光信号；（5）检测分析：分析检测数据。所述引物选用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成为RNA序列，3’端12nt合成为DNA序列；Blocker选用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修饰，中间随机加上五个XNA修饰。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六种堿基中的一种。步骤（1）所述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或水洗法结合商业化试剂盒法。
实施例3：
本发明志贺氏菌含量检测方法，包括如下步骤：（1）取含志贺氏菌的待检样品，提取基因组DNA：称取3g待检样品到盛有27mLGN增菌液的50mL的离心管中，涡旋震荡8min，混合均匀得混合物；取0.5mLGN增菌液稀释混匀的混合物加入到经过灭菌的4.5mLGN增菌液中得到各个稀释梯度，设6个稀释度；采用三管或者五管平行法，每个稀释度设3-5个重复样，于37℃培养20h，直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养，称之为菌液；（2）选择性增菌培养：移取步骤（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志贺氏菌增菌肉汤中，37℃培养20h；（3）DNA提取：移取步骤（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL离心管中，10000g离心3min，弃去上清液；再加入1mL无菌PBS缓冲液，轻轻吹打均匀，10000g离心3min，弃去上清液；加入10μL超纯水，液氮冷冻和沸水浴反复冻融3次，然后10000g离心3min取上清液，完成DNA提取；提取后的DNA短时间内4℃保存，长时间-20℃保存；（4）建立志贺氏菌的实时荧光单引物等温扩增25μL反应体系：RNA/DNA组合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用灭菌DEPC水补足体系；所述SYBERGreenⅡ为300倍稀释；将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上58℃反应40min，反应过程中实时监测荧光信号；（5）检测分析：分析检测数据。所述引物选用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成为RNA序列，3’端12nt合成为DNA序列；Blocker选用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修饰，中间随机加上五个XNA修饰。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六种堿基中的一种。步骤（1）所述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或水洗法结合商业化试剂盒法。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。