本发明涉及一种检测方法，具体是一种食物中沙门氏菌属含量的检测方法。
背景技术：
对于沙门氏菌的检测，可以分为培养法、免疫学检测法和核酸检测法三类。培养法和免疫学检测法通常是根据沙门氏菌的生长特性，采用选择性的培养基使沙门氏菌成为优势菌群，然后基于沙门氏菌的生化特性和菌体表面抗原特性，利用生化反应和抗原-抗体反应的特异性进行沙门氏菌的检测。这些方法大都存在操作复杂、易受干扰、难以定量检测的问题。核酸检测法是利用PCR技术对沙门氏菌保守的基因片段进行检测来实现准确检测的目的，然而其最大的弊端是无法区分活体和已死亡的菌体，单纯利用PCR技术无法深入研究食物中沙门氏菌对人体健康的影响。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种食物中沙门氏菌属含量的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种食物中沙门氏菌属含量的检测方法，包括如下步骤：步骤一，样品采集：用预先灭菌的采样瓶采集食物10g，食物采集后立即放入冰盒内保存，2-5h内进行检测；步骤二，食物的浓缩：对于沙门氏菌浓度低的食物，真空抽滤1000mL食物通过微孔滤膜，过滤完毕后取出滤膜，置于已灭菌的烧杯中，加入10mL磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，用磁力搅拌洗脱滤膜30min；弃滤膜，保存洗脱产物，取洗脱产物1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10-0、10-1和10-2三种稀释度的样品；对于沙门氏菌浓度高的食物，取原水1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10-0、10-1和10-2稀释度的样品；步骤三，食物前增菌：将10-0、10-1和10-2这三种稀释度的样品分别加入前增菌液混匀，每个稀释度做5份，放入37℃恒温培养箱中培养24h；步骤四，选择性增菌：将各个稀释度样品的前增菌产物1mL转入到100mL选择性增菌液中并混匀，在42℃下进行选择性增菌培养24h；步骤五，平板划线分离：挑取选择性增菌产物，分别在XLD平板和BS平板上划线分离和培养，其中，XLD平板在37℃下培养24h，BS平板在37℃下培养48h；步骤六，阳性菌落的鉴定：培养完毕，观察在XLD和BS平板上生长的菌落形态，分别挑取不同形态的菌落，置于PCR反应管中，以沙门氏菌属通用引物进行扩增，扩增片段长度为284bp；并对PCR产物在100V下电泳10-30min，观察在284bp位置上是否有明亮的扩增条带出现，若有，则该菌落为沙门氏菌阳性；所述的沙门氏菌属通用引物包括上游引物139和下游引物141；在所述XLD平板中使沙门氏菌属通用引物和阳性菌落接触以形成经接种的培养装置；在高于40℃的温度下温育培养装置第一时间段；观察所述培养装置；步骤七，鉴定XLD和BS两种平板上的阳性菌落，并进行互补计数，对于每个稀释度的样品，对应的XLD平板和BS平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度即为阳性；以阳性组合的方式记录平板上阳性菌落的结果，对照MPN表查找对应的MPN值，除以在步骤二中食物浓缩的倍数，得到100mL食物的沙门氏菌活体含量。
作为本发明进一步的方案：其中所述培养装置被提供为薄膜培养装置，所述薄膜培养装置具有以基本上脱水的形式设置在其中的所述营养物质培养基、所述第一选择剂、所述第一区别性指示剂系统和所述第二区别性指示剂系统。
作为本发明再进一步的方案：所述的PCR扩增的条件是：（1）PCR反应体系总体积25µL，其中各成分终浓度为：引物139和引物141各0.4μmol/L，0.75UTaq酶，0.8mmol/LdNTPs，2.5mmol/LMgCl2；（2）PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为：95℃预变性5min；95℃，30s，65℃，30s，72℃，30s，进行30个循环；最后72℃延伸4min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明能够定量检测食物中沙门氏菌活体含量，并提高检测的特异性，操作简便可行。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中，一种食物中沙门氏菌属含量的检测方法，包括如下步骤：步骤一，样品采集：用预先灭菌的采样瓶采集食物10g，食物采集后立即放入冰盒内保存，2-5h内进行检测；步骤二，食物的浓缩：对于沙门氏菌浓度低的食物，真空抽滤1000mL食物通过微孔滤膜，过滤完毕后取出滤膜，置于已灭菌的烧杯中，加入10mL磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，用磁力搅拌洗脱滤膜30min；弃滤膜，保存洗脱产物，取洗脱产物1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10-0、10-1和10-2三种稀释度的样品；对于沙门氏菌浓度高的食物，取原水1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10-0、10-1和10-2稀释度的样品；步骤三，食物前增菌：将10-0、10-1和10-2这三种稀释度的样品分别加入前增菌液混匀，每个稀释度做5份，放入37℃恒温培养箱中培养24h；步骤四，选择性增菌：将各个稀释度样品的前增菌产物1mL转入到100mL选择性增菌液中并混匀，在42℃下进行选择性增菌培养24h；步骤五，平板划线分离：挑取选择性增菌产物，分别在XLD平板和BS平板上划线分离和培养，其中，XLD平板在37℃下培养24h，BS平板在37℃下培养48h；步骤六，阳性菌落的鉴定：培养完毕，观察在XLD和BS平板上生长的菌落形态，分别挑取不同形态的菌落，置于PCR反应管中，以沙门氏菌属通用引物进行扩增，扩增片段长度为284bp；并对PCR产物在100V下电泳10-30min，观察在284bp位置上是否有明亮的扩增条带出现，若有，则该菌落为沙门氏菌阳性；所述的沙门氏菌属通用引物包括上游引物139和下游引物141；在所述XLD平板中使沙门氏菌属通用引物和阳性菌落接触以形成经接种的培养装置；在高于40℃的温度下温育培养装置第一时间段；观察所述培养装置；步骤七，鉴定XLD和BS两种平板上的阳性菌落，并进行互补计数，对于每个稀释度的样品，对应的XLD平板和BS平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度即为阳性；以阳性组合的方式记录平板上阳性菌落的结果，对照MPN表查找对应的MPN值，除以在步骤二中食物浓缩的倍数，得到100mL食物的沙门氏菌活体含量。其中所述培养装置被提供为薄膜培养装置，所述薄膜培养装置具有以基本上脱水的形式设置在其中的所述营养物质培养基、所述第一选择剂、所述第一区别性指示剂系统和所述第二区别性指示剂系统。所述的PCR扩增的条件是：（1）PCR反应体系总体积25µL，其中各成分终浓度为：引物139和引物141各0.4μmol/L，0.75UTaq酶，0.8mmol/LdNTPs，2.5mmol/LMgCl2；（2）PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为：95℃预变性5min；95℃，30s，65℃，30s，72℃，30s，进行30个循环；最后72℃延伸4min。
实施例1：
本发明食物中沙门氏菌属含量的检测方法，包括如下步骤：步骤一，样品采集：用预先灭菌的采样瓶采集食物10g，食物采集后立即放入冰盒内保存，2h内进行检测；步骤二，食物的浓缩：对于沙门氏菌浓度低的食物，真空抽滤1000mL食物通过微孔滤膜，过滤完毕后取出滤膜，置于已灭菌的烧杯中，加入10mL磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，用磁力搅拌洗脱滤膜30min；弃滤膜，保存洗脱产物，取洗脱产物1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10-0、10-1和10-2三种稀释度的样品；对于沙门氏菌浓度高的食物，取原水1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10-0、10-1和10-2稀释度的样品；步骤三，食物前增菌：将10-0、10-1和10-2这三种稀释度的样品分别加入前增菌液混匀，每个稀释度做5份，放入37℃恒温培养箱中培养24h；步骤四，选择性增菌：将各个稀释度样品的前增菌产物1mL转入到100mL选择性增菌液中并混匀，在42℃下进行选择性增菌培养24h；步骤五，平板划线分离：挑取选择性增菌产物，分别在XLD平板和BS平板上划线分离和培养，其中，XLD平板在37℃下培养24h，BS平板在37℃下培养48h；步骤六，阳性菌落的鉴定：培养完毕，观察在XLD和BS平板上生长的菌落形态，分别挑取不同形态的菌落，置于PCR反应管中，以沙门氏菌属通用引物进行扩增，扩增片段长度为284bp；并对PCR产物在100V下电泳10-30min，观察在284bp位置上是否有明亮的扩增条带出现，若有，则该菌落为沙门氏菌阳性；所述的沙门氏菌属通用引物包括上游引物139和下游引物141；在所述XLD平板中使沙门氏菌属通用引物和阳性菌落接触以形成经接种的培养装置；在高于40℃的温度下温育培养装置第一时间段；观察所述培养装置；步骤七，鉴定XLD和BS两种平板上的阳性菌落，并进行互补计数，对于每个稀释度的样品，对应的XLD平板和BS平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度即为阳性；以阳性组合的方式记录平板上阳性菌落的结果，对照MPN表查找对应的MPN值，除以在步骤二中食物浓缩的倍数，得到100mL食物的沙门氏菌活体含量。其中所述培养装置被提供为薄膜培养装置，所述薄膜培养装置具有以基本上脱水的形式设置在其中的所述营养物质培养基、所述第一选择剂、所述第一区别性指示剂系统和所述第二区别性指示剂系统。所述的PCR扩增的条件是：（1）PCR反应体系总体积25µL，其中各成分终浓度为：引物139和引物141各0.4μmol/L，0.75UTaq酶，0.8mmol/LdNTPs，2.5mmol/LMgCl2；（2）PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为：95℃预变性5min；95℃，30s，65℃，30s，72℃，30s，进行30个循环；最后72℃延伸4min。
实施例2：
本发明食物中沙门氏菌属含量的检测方法，包括如下步骤：步骤一，样品采集：用预先灭菌的采样瓶采集食物10g，食物采集后立即放入冰盒内保存，5h内进行检测；步骤二，食物的浓缩：对于沙门氏菌浓度低的食物，真空抽滤1000mL食物通过微孔滤膜，过滤完毕后取出滤膜，置于已灭菌的烧杯中，加入10mL磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，用磁力搅拌洗脱滤膜30min；弃滤膜，保存洗脱产物，取洗脱产物1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10-0、10-1和10-2三种稀释度的样品；对于沙门氏菌浓度高的食物，取原水1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10-0、10-1和10-2稀释度的样品；步骤三，食物前增菌：将10-0、10-1和10-2这三种稀释度的样品分别加入前增菌液混匀，每个稀释度做5份，放入37℃恒温培养箱中培养24h；步骤四，选择性增菌：将各个稀释度样品的前增菌产物1mL转入到100mL选择性增菌液中并混匀，在42℃下进行选择性增菌培养24h；步骤五，平板划线分离：挑取选择性增菌产物，分别在XLD平板和BS平板上划线分离和培养，其中，XLD平板在37℃下培养24h，BS平板在37℃下培养48h；步骤六，阳性菌落的鉴定：培养完毕，观察在XLD和BS平板上生长的菌落形态，分别挑取不同形态的菌落，置于PCR反应管中，以沙门氏菌属通用引物进行扩增，扩增片段长度为284bp；并对PCR产物在100V下电泳10-30min，观察在284bp位置上是否有明亮的扩增条带出现，若有，则该菌落为沙门氏菌阳性；所述的沙门氏菌属通用引物包括上游引物139和下游引物141；在所述XLD平板中使沙门氏菌属通用引物和阳性菌落接触以形成经接种的培养装置；在高于40℃的温度下温育培养装置第一时间段；观察所述培养装置；步骤七，鉴定XLD和BS两种平板上的阳性菌落，并进行互补计数，对于每个稀释度的样品，对应的XLD平板和BS平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度即为阳性；以阳性组合的方式记录平板上阳性菌落的结果，对照MPN表查找对应的MPN值，除以在步骤二中食物浓缩的倍数，得到100mL食物的沙门氏菌活体含量。其中所述培养装置被提供为薄膜培养装置，所述薄膜培养装置具有以基本上脱水的形式设置在其中的所述营养物质培养基、所述第一选择剂、所述第一区别性指示剂系统和所述第二区别性指示剂系统。所述的PCR扩增的条件是：（1）PCR反应体系总体积25µL，其中各成分终浓度为：引物139和引物141各0.4μmol/L，0.75UTaq酶，0.8mmol/LdNTPs，2.5mmol/LMgCl2；（2）PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为：95℃预变性5min；95℃，30s，65℃，30s，72℃，30s，进行30个循环；最后72℃延伸4min。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。