癌症相关基因表达差异检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及试剂盒及其应用技术领域，特别是指一种癌症相关基因表达差异检测试剂盒及其应用。

背景技术：

近年来，癌症与心血管系统疾病，呼吸系统疾病及糖尿病均排在致死疾病前列，十年来癌症发病率也呈上升趋势。据国家癌症中心统计数据，2015年中国癌症总发病429.16万例，总死亡281.42万例，肺癌和胃癌位居全国癌症发病及死亡的前两位。男性所有肿瘤发病率2000年至2011年略显稳定(年增长0.2％)，女性则较为显著(年增长2.2％)。目前根据各种癌症的预后大体可分为三类情况：第一类，早期治疗可以达到根治；第二类，早期发现可以达到较好的疗效但即使是早期手术仍有一定比例的病例发生转移；第三类，整体疗效提高不明显。因此，进一步研究癌症的发生发展机制，寻找新的肿瘤标志物和探索新的靶向药物，已成为癌症研究亟待解决的三大问题。

癌症的发生发展是一个非常复杂的基因与环境相互作用的过程，研究表明，促癌基因或抑癌基因的表达发生改变影响着大多数癌症的发生发展。因此，高效准确的检测基因的表达差异，成为研究癌症的发生发展，寻找新的肿瘤标志物以及探索癌症个性化治疗的一个重要步骤。

目前用来进行基因差异表达的检测方法有Northern杂交(Northern blotting)，逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription PCR)以及基因芯片等，每种方法都有各自的优缺点。Northern杂交法可以对目标转录本的大小和含量进行检测，但是通量较小。基因芯片也是利用核算杂交的原理，将大量探针固定于支持物上，可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(Southern Blotting和Northern Blotting等)技术操作繁杂、检测通量小、检测效率低等不足。但是由于存在非特异杂交的可能，所以基因芯片的灵敏度和准确性也会受到影响，因此许多研究人员使用RT-PCR的方法对基因芯片的结果进行验证。RT-PCR一直是人们长期以来用于检测基因表达的一项技术，具有快速灵敏的特点。易降解的RNA首先逆转录成稳定的cDNA，以此为模板进行聚合酶链式扩增。随着技术的发展，实时荧光PCR(real-time PCR)技术也被用来做定量分析，它们比普通PCR进行定量分析时灵敏度更高，定量更精确，因此更多的为研究人员所使用。

技术实现要素：

本发明提出一种癌症相关基因表达差异检测试剂盒及其应用，解决了现有技术中通量较小或灵敏度和准确性较差的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种癌症相关基因表达差异检测试剂盒，包括：

cDNA模板；

管家基因引物，所述管家基因引物为管家基因β-actin的正向及反向引物一对。

其中所述cDNA模板是由人类癌症组织及其相应癌旁组织抽提的RNA反转录得到的。所有组织cDNA模板来源病人的临床资料。

作为优选的技术方案，所述管家基因β-actin的正向及反向引物为SEQ ID NO：1-2所示序列的核苷酸链或其互补链。

作为优选的技术方案，所述管家基因β-actin的序列为SEQ ID NO：3所示序列的核苷酸链或其互补链。

作为优选的技术方案，所述癌症相关基因表达差异检测试剂盒采用DNA聚合酶，所述DNA聚合酶为无核酸外切酶活性，包括5’核酸外切酶活性和3’核酸外切酶活性。

作为优选的技术方案，所述癌症相关基因表达差异检测试剂盒采用PCR反应程序，PCR反应程序中PCR循环时的退火温度低于正向及反向引物的Tm值。

作为优选的技术方案，所述PCR反应条件为：95℃预变性10分钟，95℃15秒，58℃40秒，扩增反应40循环，在60℃40秒阶段收集荧光。

本发明还提供一种癌症相关基因表达差异检测试剂盒的应用，具体为检测试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：

利用聚合酶链式反应体系，经过变性打开DNA双链，根据引物的Tm值(DNA的解链温度)选择退火和延伸温度进行DNA的退火和延伸，此过程中上下游引物会特异的与cDNA的目的区域结合，并进行核苷酸链式聚合反应，最后进行荧光收集；通过实时荧光定量的方法来检测目的基因的表达；并且利用分析软件对目的基因的表达量与样本的临床信息进行相关性分析；

其中所述聚合酶链式反应体系中包含带有癌症病人完整临床信息的癌症和癌旁组织提取的cDNA(所有样本的cDNA经过精确的定量和均一化)，及一对管家基因β-actin的正向及反向引物。

作为优选的技术方案，所述cDNA模板的制备如下：

提取病人癌症和癌旁组织的RNA；

在所述的RNA中加入基因组DNA酶消化残留在其中的基因组DNA，经过纯化后，收集总RNA；利用RNA反转录酶，合成cDNA；之后加入容器中，冻干即得cDNA模板。

有益效果

(1)本发明癌症相关基因表达差异检测试剂盒的检测方法在同一次PCR反应中多个样本进行靶基因差异表达检测，利用荧光定量PCR仪的简便性和高灵敏度读取结果，判读所检测的目的基因在大量癌症样本中的表达情况，并且可结合病人临床信息进行相关性分析。

(2)本发明结合了PCR的高度灵敏度和样本通量高等优点，具有操作简单、结果准确并可进行统计学分析相关性的特点。

(3)本发明有助于研究人员深入研究癌症发生发展机制，探索及验证肿瘤标志物和药物靶点。本发明可对目的基因表达与样本临床信息的相关性进行分析，寻找癌症标志物或药物靶点，从而判定目的基因的临床意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2中β-actin荧光定量Ct值柱状图。

图2为实施例2中MTA3与beta-actin的-△△Ct值的柱状图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种癌症相关基因表达差异检测试剂盒，包括：cDNA模板以及管家基因引物。其中cDNA模板的制备如下：提取病人癌症和癌旁组织的RNA；在的RNA中加入基因组DNA酶消化残留在其中的基因组DNA，经过纯化后，收集总RNA；然后，对纯化过后的RNA进行质量检测，挑选出高质量的RNA，利用RNA反转录酶，合成cDNA。最后，各样本的cDNA经过精确定量后，按照每孔等量的原则，均一的加入用于PCR的96孔板，冻干后制备成cDNA模板。管家基因引物为管家基因β-actin的正向及反向引物一对。具体可选择β-actin的正向及反向引物为SEQ ID NO：1-2所示序列的核苷酸链或其互补链。或者β-actin的序列为SEQ ID NO：3所示序列的核苷酸链或其互补链。

其序列如下：

SEQ ID NO：1：GAAGAGCTACGAGCTGCCTGA

SEQ ID NO：2：CAGACAGCACTGTGTTGGCG

SEQ ID NO：3：

GAAGAGCTACGAGCTGCCTGACGGCCAGGTCATCACCATTGGCAATGAGC

GGTTCCGCTGCCCTGAGGCACTCTTCCAGCCTTCCTTCCTGGGCATGGAG

TCCTGTGGCATCCACGAAACTACCTTCAACTCCATCATGAAGTGTGACGT

GGACATCCGCAAAGACCTGTACGCCAACACAGTGC TGTC

本实施例中癌症相关基因表达差异检测试剂盒采用DNA聚合酶，所述DNA聚合酶为无核酸外切酶活性，包括5’核酸外切酶活性和3’核酸外切酶活性。

另外癌症相关基因表达差异检测试剂盒采用PCR反应程序，PCR反应程序中PCR循环时的退火温度低于正向及反向引物的Tm值。

其中cDNA模板是由人类癌症组织及其相应癌旁组织抽提的RNA反转录得到的。所有组织cDNA模板来源病人的临床资料。

实施例2

癌症相关基因表达差异检测试剂盒的应用，具体为试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：

(1)cDNA模板的制备。

其制备包括以下步骤：

先提取病人癌症和癌旁组织的RNA，加入基因组DNA酶消化残留在其中的基因组DNA，经过纯化后，收集总RNA。然后，对纯化过后的RNA进行质量检测，挑选出高质量的RNA，利用RNA反转录酶，合成cDNA。最后，各样本的cDNA经过精确定量后，按照每孔等量的原则，均一的加入用于PCR的96孔板，冻干后制备成cDNA模板。

(2)对癌症相关基因进行检测。

利用聚合酶链式反应体系完成。聚合酶链式反应体系所需的模板和引物，为权利要求1所述的包含带有癌症病人完整临床信息的从人类癌症和癌旁组织提取的cDNA模板，及一对特异性管家基因的上游引物和下游引物，反应的基本步骤如下：首先，将cDNA芯片从-20℃中取出，置于室温1min，在离心管中配置反应体系溶液；然后去掉cDNA芯片的封膜，将上述混合液混匀后，以20μl/孔加入cDNA阵列中；用新的封膜将cDNA芯片封住，注意一定要仔细贴紧，封好后，将孔板放置于冰上15min，使得冻干的cDNA充分溶解，轻轻震荡后，2000-6000rpm离心1min；将孔板放入PCR仪，设定好程序，进行PCR实验，经过变性打开DNA双链，根据引物的Tm值选择合适的退火和延伸温度进行DNA的退火和延伸，此过程中上下游引物会特异的与cDNA的目的区域结合，并进行核苷酸链式聚合反应，最后进行荧光收集；由此，通过实时荧光定量的方法来检测目的基因的表达；最后，通过计算目的基因与管家基因-△△Ct值的方法得到目的基因的差异表达情况。

(3)结果与临床资料的相关性分析。病人的临床信息，可用于与目的基因表达的相关性分析。

通过检测癌症相关基因MTA3的差异表达的一个例子进行说明，其根据本方法特点，设计合成MTA3的引物。以管家基因β-actin为内参，引物参照SEQ ID NO：1-2序列合成。扩增程序如下：(1)PCR扩增体系：按照以下方法配置PCR反应液。(2)PCR扩增程序如下：按照以下方法进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃预变性10分钟，95℃15秒，58℃40秒，扩增反应40循环，在60℃40秒阶段收集荧光。

结果分析如下：参照图1和图2，根据-△△Ct值-[(癌症样本Ct值-内参Ct值)-(癌旁样本Ct值-内参Ct值)]判断癌症样本中MTA3表达是否改变。-△△Ct值≥1为在癌症组织中表达显著升高，-△△Ct≤-1为在癌症组织中表达显著下降。

对有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中管家基因为有效扩增时，样本结果判断标准如下：-△△Ct值-[(癌症样本Ct值-内参Ct值)-(癌旁样本Ct值-内参Ct值)]≥1为在样本中表达显著升高，≤-1为在样本中表达显著下降。

本实施例具有以下特点：(1)使用试剂盒对组织中的RNA进行提取和质控。(2)使用商业化试剂盒对质控合格的RNA进行逆转录，得到cDNA。(3)使用高精度的核酸浓度检测仪器检测个样本cDNA浓度，并将每个样本的cDNA等量的排布在96-well或384-well PCR管中。(4)根据本方法的特点设计β-actin引物。(5)根据本方法的特点设计靶基因引物。(6)β-actin PCR反应条件为：95℃预变性10分钟，95℃15秒，58℃40秒，扩增反应40循环，在60℃40秒阶段收集荧光。(7)根据靶基因引物特点进行PCR反应。(8)计算各样本中靶基因与β-actin-△△Ct值，可结合各样本的临床信息进行相关性分析。

本发明方法具有特异性强、敏感性高、操作简单快速、定量准确性高、结果可靠性强、结果分析简单并且样本带有完整的病例临床信息和五年及以上随访记录等优势，可用于人类基因表达在癌症样本中的定量检测，有助于检测目的基因在不同病程病人的表达情况及进行深入的临床信息和预后相关性分析。

本发明用于检测人类基因在癌症及相应癌旁组织中的表达，满足研究人员对于大量样本的需求，建立样本库，收集了大量带有临床信息和5年及以上随访信息的癌症病人的癌症组织样本及相应癌旁组织样本，经过RNA抽提及严格质检，反转录成cDNA，排布在96-well或384-well PCR管中，制作成组织cDNA芯片。本发明具有样本通量高、检测快速准确、灵敏度高的特点，可以快速准确灵敏的检测目的基因在大量癌症样本中的表达情况，并且根据样本的临床信息及随访信息，研究人员可进行各种相关性的统计学分析。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海芯超生物科技有限公司

<120> 癌症相关基因表达差异检测试剂盒及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<400> 1

gaagagctac gagctgcctg a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<400> 2

cagacagcac tgtgttggcg 20

<210> 3

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(189)

<400> 3

gaagagctac gagctgcctg acggccaggt catcaccatt ggcaatgagc ggttccgctg 60

ccctgaggca ctcttccagc cttccttcct gggcatggag tcctgtggca tccacgaaac 120

taccttcaac tccatcatga agtgtgacgt ggacatccgc aaagacctgt acgccaacac 180

agtgctgtc 189