本发明涉及一种预测肺癌转移的试剂盒及其使用方法。
背景技术：
肿瘤的转移是指肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管，血管或其他途经被带到它处继续生长，形成与原发部位肿瘤相同类型的肿瘤，这个过程成为转移，所形成的肿瘤成为转移瘤或转移癌。转移是恶性肿瘤的特征。肺癌晚期可出现各个不同脏器的转移，可引起相应的症状，常常给患者带来极大的痛苦，甚至威胁到生命。肺癌脑转移的中位生存期只有4个月。少部分患者的生存期相对较长，特别是靶向药物治疗有效的患者。肺癌转移的早期诊断具有巨大的临床价值，有助于争取治疗时间，延长患者生命。临床最常见的肺癌转移有以下几个部位：脑转移、骨转移、肝转移、肾及肾上腺转移以及其它部位，比如皮肤、肌肉、皮下组织、腹腔内和心脏等部位。肺癌的转移，目前绝大多数采用医学影像学进行诊断，下面以骨转移和肝转移为例解释目前的诊断方法。肺癌骨转移诊断包括：(1)放射性核素骨扫描(ECT)检查，对肺癌骨转移的诊断率较高，能在X线平片及CT发现骨转移之前数月检出转移灶，对于多发性肺癌骨转移诊断假阳性极少，但对于单发性肺癌骨转移诊断有一定假阳性；(2)X线检查可作为肺癌骨转移诊断的基本检查手段，有助于检测溶骨性骨转移部位骨髓质和骨皮质破坏的程度，也可用于证实其他影像学的发现，但对于没有骨破坏的转移灶灵敏度低；(3)计算机断层扫描(CT)检查，CT对肺癌骨转移的诊断比X线灵敏。能发现早期骨质破坏，一般无假阳性，但难以发现跳跃性椎体转移灶；(4)核磁共振成像(MRI)检查：MRI对肺癌骨转移的诊断高度敏感。肺癌疑有骨转移者应常规行骨显像检查，对多发性且明显放射性浓聚者判断为骨转移，而对于单发浓聚者采用X线平片或CT进一步证实，而多发性浓聚不太明显者采用MRI检查。肺癌肝转移诊断包括：(1)腹部彩色超声，为临床诊断肺癌发生肝转移及治疗后随诊的首选方法，一般1-2cm以上肝转移癌灶均可能显像，总的临床诊断准确率可达90％；(2)腹部计算机断层扫描(CT)，目前已成为诊断肺癌肝转移的常规检查方法，可检出1-2cm或更小的转移性癌灶，其敏感度可超过90％；(3)核磁共振成像(MRI)，肺癌肝转移表现为边界清楚，信号强度均匀或强弱不等的多发或单发病灶，可呈现“靶征”或“亮环征”，其敏感性与CT相近；(4)选择性腹腔动脉或肝动脉造影，常可显示出1cm或更小的肝转移癌灶，对肝内占位性质难以确定、病灶较大、边界欠清、怀疑肝内有卫星转移癌灶者，可考虑行选择性动脉造影；(5)正电子发射计算机断层显像(PET)，PET获得的断层图像主要反映组织/细胞的代谢信息，可以直接对人体进行生理、生化的代谢研究，在肿瘤发生早期，即在其病理变化之前就可能发现肿瘤存在，但因其价格昂贵，目前尚不能普遍应用，只能作为一种特殊的检查方法。在临床上，目前的主流还是采用医学影像学对肺癌的转移进行诊断，其缺点有三个：(1)影像学指标不够客观，对于一些微小的肿瘤灶识别人为因素大，要求临床经验丰富的医生进行识别；(2)通过影像学识别到的肿瘤转移灶，确认肿瘤转移并生长到一定程度，对于患者来说已经处于转移的晚期了，不利于早期治疗；(3)部分检测价格昂贵。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种预测肺癌转移的试剂盒和使用方法，通过对DNA修复系统信号通路的相关35个基因进行相关突变检测，结合特有打分机制快速便捷判定、预测结肺癌转移。
本发明的一种预测肺癌转移的试剂盒，包括DNA建库试剂盒，所述DNA建库试剂盒包括多个基因的探针，所述多个基因包括：
高危基因：BRCA1、BRCA2、PALB2、ATM、ATR、MUTYH、EMSY、ERCC4、RAD51、PARP1、XRCC1；和
低危基因分：ATRX、BRIP1、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCL、FANCM、FANCO、FANCP、MDM2、MDM4、MLH1、NPM1、PP2R1A、PRKDC、RAD50、STAG2、XRCC5、XRCC6。
进一步的，所述DNA建库试剂盒还包括可从商业途径购买的常规试剂：T4DNA连接酶、DNA末端修复酶、高保真DNA合成酶和各种酶反应缓冲液等，DNA建库试剂盒由多个小试剂盒组成，如KAPA Hyper Prep Kit试剂盒(KAPA公司)、SeqCap Adapter Kit(Roche公司)、SeqCap EZ HE-Oligo Kit试剂盒(Roche公司)、SeqCap EZ Accessory Kit试剂盒(Roche公司)、SeqCap EZ Pure Capture Beads Kit试剂盒(Roche公司)和SeqCap EZ Hyb and Wash Kit试剂盒(Roche公司)。
进一步的，所述试剂盒内还包括真空采血管。
进一步的，所述试剂盒内还包括DNA抽提试剂盒。
进一步的，所述DNA抽提试剂盒包括可从商业途径购买的常规试剂：异丙醇、RNA酶、蛋白酶K和各种酶反应缓冲液等，如QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒(QIAGEN公司)。
本发明的一种预测结直肠癌肝转移的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)采用血液DNA提取试剂盒抽提血液样本中游离DNA(cfDNA)，抽提的游离DNA中含有肺癌肿瘤细胞释放的DNA，携带有肿瘤细胞特异性的基因突变。
(2)采用DNA建库试剂盒对步骤(1)中抽提的游离DNA进行建库；所述DNA建库试剂盒包括35个基因的探针，所述基因包括：
高危基因：BRCA1、BRCA2、PALB2、ATM、ATR、MUTYH、EMSY、ERCC4、RAD51、PARP1、XRCC1；
低危基因：ATRX、BRIP1、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCL、FANCM、FANCO、FANCP、MDM2、MDM4、MLH1、NPM1、PP2R1A、PRKDC、RAD50、STAG2、XRCC5、XRCC6。
(3)对步骤(2)中建库的DNA进行测序，获得DNA全长序列。
(4)通过生物信息方法对步骤(3)中得到的DNA全长序列进行基因突变分析。
进一步的，在步骤(1)之前，还包括使用真空采血管采集血液样本的步骤，并在样本采集72小时内进行游离DNA抽提。
进一步的，步骤(4)中，所述基因突变包括导致肺癌转移的概率依次降低的失活突变、致病性突变、非致病性非同义突变和同义突变，根据所述概率对突变设定分值，将这些基因的突变按如表1中的规则进行评分：
进一步的，根据DNA中基因突变的种类和数量得到分数，将该分数与总分数对比来判断肺癌转移的概率。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明的试剂盒通过血液基因检测来预测肺癌转移概率，首先采用二代测序检测患者血液中对DNA修复系统信号通路的相关35个基因基因突变情况，通过一套客观的打分规则表来预测肺癌转移的概率，相比于医学影像学诊断，通过本发明的试剂盒进行血液基因检测的结果客观，重复性高；可以在肺癌的早期通过基因检测的手段来预测其转移的概率，辅助患者进行早期预防肿瘤转移及治疗，争取到更多的治疗时间；成本低，价格便宜。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
使用本发明的试剂盒进行预测肺癌转移的方法，包括以下步骤：
(1)采血，采集患者的血液5ml，保存于真空采血管中，72小时内进行cfDNA的抽提；
(2)DNA抽提，采用血液DNA提取试剂盒抽提血液中游离的DNA，其中含有少量的肺癌肿瘤细胞释放的DNA，包含有肿瘤细胞特异性的基因突变；
(3)建库，采用DNA建库试剂盒，对血液游离DNA进行建库；
(4)测序，采用Illumina二代测序平台，对DNA进行测序，获得35个基因的全长序列；
(5)基因突变检测：测序结果下机后，通过生物信息学，分析基因突变情况；
(6)系统评分，通过前期的研究及数据积累，将与DNA修复系统信号通路的35个DNA修复相关基因(其突变与肺癌的转移密切相关)分为高危基因和低危基因，高危基因分别为：BRCA1、BRCA2、PALB2、ATM、ATR、MUTYH、EMSY、ERCC4、RAD51、PARP1、XRCC1；低危基因分别为：ATRX、BRIP1、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCL、FANCM、FANCO、FANCP、MDM2、MDM4、MLH1、NPM1、PP2R1A、PRKDC、RAD50、STAG2、XRCC5、XRCC6，并按以下规则进行评分(表1)：
各种突变的定义及打分规则如下：
失活突变为以下4种类型的突变：提前终止(Stopgain)、终止子缺失(Stoploss)、移码突变(Frameshift)和第一位甲硫氨酸突变(M1)；某个基因如检测到失活突变，则直接评分，不再参与后续的打分，例如BRCA1发生移码突变，则直接打20分，其它致病性突变，非同义突变和同义突变都不再评分；致病性突变为Clinvar在线数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)中记载为pathogenic的变异(致病性变异)；某个基因如未检测到失活突变，检测到致病性突变则直接评分，不再参与后续的打分，例如BRCA1未发生失活突变，发生一个致病性突变，则直接打18分，其它非同义突变和同义突变都不再评分；非致病性非同义突变为改变氨基酸的变异，但是在Clinvar在线数据库中记载为良性变异或未记载；同义突变为未改变氨基酸的变异。对于任意一个患者，其测序结果都可以按以上评分表进行打分，最高分为460分，230分作为临界判定点。
肺癌转移概率的打分系统可以归一化为百分比，以50％作为界限，大于50％的，预测肺癌转移的概率很高，需要预防及提前进行治疗，小于50％的，预测短时间内(1-2年)不会发生肺癌转移。
以下以两个肺癌患者为例：
肺癌患者1，年龄35岁，临床诊断为肺癌，经本发明的试剂盒检测后，总评分为264.5，概率超过50％，预测为肺癌转移的高风险，8个月后检测到肺癌脑转移，其检测到的35个基因突变及具体的评分情况如表2和表3所示：
肺癌患者2，年龄67岁，临床诊断为小细胞肺癌，经本发明的试剂盒检测后，总评分为199.75，概率低于50％，预测为肺癌转移的低风险，13个月后仍然未检测到肺癌脑转移，其检测到的35个基因突变及具体的评分情况如表4和表5所示：
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。