一种志贺氏菌含量检测方法与流程

文档序号:12412694阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种志贺氏菌含量检测方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)取含志贺氏菌的待检样品,提取基因组DNA:称取3g待检样品到盛有27mLGN增菌液的50mL的离心管中,涡旋震荡5-10min,混合均匀得混合物;取0.5mLGN增菌液稀释混匀的混合物加入到经过灭菌的4.5mLGN增菌液中得到各个稀释梯度,设5-7个稀释度;采用三管或者五管平行法,每个稀释度设3-5个重复样,于37℃培养18-24h,直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养,称之为菌液;(2)选择性增菌培养:移取步骤(1)所得各管中菌液0.5mL加入到志贺氏菌增菌肉汤中,37℃培养18-24h;(3)DNA提取:移取步骤(2)所得各管中菌液2mL加入到10mL离心管中,10000g离心3min,弃去上清液;再加入1mL无菌PBS缓冲液,轻轻吹打均匀,10000g离心3min,弃去上清液;加入10μL超纯水,液氮冷冻和沸水浴反复冻融3次,然后10000g离心3min取上清液,完成DNA提取;提取后的DNA短时间内4℃保存,长时间-20℃保存;(4)建立志贺氏菌的实时荧光单引物等温扩增25μL反应体系:RNA/DNA组合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL,其余用灭菌DEPC水补足体系;所述SYBERGreenⅡ为300倍稀释;将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃,90s处理后降温至60℃,迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶,在实时荧光定量PCR仪上58℃反应40min,反应过程中实时监测荧光信号;(5)检测分析:分析检测数据。

2.根据权利要求1所述的志贺氏菌含量检测方法,其特征在于,所述引物选用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC,5’端9nt合成为RNA序列,3’端12nt合成为DNA序列;Blocker选用TTAGATAATGTGGTA,3’端用生物素修饰,中间随机加上五个XNA修饰。

3.根据权利要求2所述的志贺氏菌含量检测方法,其特征在于,所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六种堿基中的一种。

4.根据权利要求1所述的志贺氏菌含量检测方法,其特征在于,步骤(1)所述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或水洗法结合商业化试剂盒法。

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