本发明涉及食品领域，具体的，本发明涉及检测左旋肉碱含量的方法。
背景技术：
：左旋肉碱(L-carnitine)，又称L-肉碱或音译卡尼丁，是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸，红色肉类是左旋肉碱的主要来源，对人体无毒副作用。左旋肉碱的主要生理功能是促进脂肪转化成能量，服用左旋肉碱能够在减少身体脂肪、降低体重的同时，不减少水分和肌肉。目前国标法检测左旋肉碱含量，采用紫外分光光度法，一方面由于乙酰辅酶A和肉碱乙酰转移酶费用昂贵，一方面在比色阶段花费时间较长。因此，目前国标法检测左旋肉碱含量的方法在使用上很大程度上受限于自身的缺陷。如何快速而高准确度的检测食品中左旋肉碱的含量，仍需进一步研究。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种快速、准确地检测食品中左旋肉碱含量的方法。在本发明的第一方面，本发明提出了一种检测左旋肉碱含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待测样品与显色液和乙酰辅酶A进行第一接触和第一酶标检测；将第一接触后样品与肉碱乙酰转移酶进行第二接触和第二酶标检测；以及基于第二酶标检测与第一酶标检测的差值，确定待测样品中左旋肉碱的含量。利用根据本发明实施例的检测左旋肉碱含量的方法，能够快速、准确地检测食品中左旋肉碱含量，检测时间相比于现有技术，缩短到15min左右，检测效率，相比于现有技术，实现了批量检测，检测灵敏度，相比于现有技术，检出限低至0.5mg/100g，定量限低至1.5mg/100g。根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述第一酶标检测和所述第二酶标检测的检测波长为405nm。发明人通过波长筛选实验发现，在检测波长405nm下，第一酶标检测和第二酶标检测差值大，检测灵敏度更高。根据本发明的实施例，所述乙酰辅酶A是以水溶液的形式提供的，所述乙酰辅酶A的浓度为0.2～0.4mg/ml，优选0.4mg/ml；所述肉碱乙酰转移酶是以水溶液的形式提供的，所述肉碱乙酰转移酶的酶活为15～45units/ml。发明人在实验中发现，乙酰辅酶A和肉碱乙酰转移酶的酶活在上述剂量下，对食品中乙酰辅酶A的检测灵敏度和准确度更高。根据本发明的实施例，所述待测样品、所述显色液、所述乙酰辅酶A和所述肉碱乙酰转移酶的体积为100:40:50:50。发明人发现，在上述体积比下，显色反应充分，对食品中乙酰辅酶A检测准确度进一步提高，且不会造成显色反应试剂的浪费。根据本发明的实施例，所述第二接触的时间为10～20min，优选10min。发明人通过条件筛选实验发现，第二接触的时间为10～20min范围内，标准曲线方程的线性较好，更进一步地，优选10min，这样既保证了标准曲线的线性，又保证了较强的吸光度，对样品中左旋肉碱含量的检测更加准确、可靠、灵敏。根据本发明的实施例，所述基于第二酶标检测与第一酶标检测的差值，确定待测样品中左旋肉碱的含量是通过如下方式实现的：将所述差值与标准曲线进行比对，其中，所述标准曲线是通过对左旋肉碱标准工作液进行酶标检测获得的。通过上述方式获得标准曲线，进而用于比对，可进一步提高检测结果的准确度，提高检测结果的稳定性。根据本发明的实施例，所述左旋肉碱标准工作液是左旋肉碱标准品的水溶液，所述左旋肉碱标准品的浓度分别为1.6μg/ml，3.2μg/ml，6.4μg/ml，9.6μg/ml，16μg/ml。发明人通过实验发现，在上述浓度梯度的左旋肉碱标准品下，所得出的标准曲线适于与食品中左旋肉碱的吸光度对应的差值进行比对，左旋肉碱的吸光度对应的差值在标准曲线精确比对的区间，进而测得的食品中左旋肉碱的含量更加准确。在本发明的第二方面，本发明提出了一种检测左旋肉碱含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)吸取制备好的左旋肉碱标准工作液和待测样品100uL于96孔微孔板中，每孔加入40uL显色液和50μL乙酰辅酶A溶液，混合均匀后放入酶标仪样品室中，检测波长调为405nm，5min后进行读数，结果记录为A1；(2)拿出微孔板，每孔加入50μL肉碱乙酰转移酶溶液，混合均匀后放入酶标仪样品室中，反应10min后读数，结果记录为A2；(3)以左旋肉碱标准工作液的浓度为横坐标，以左旋肉碱标准工作液的吸光值A2-A1为纵坐标，制作标准曲线；以及(4)将待测样品的吸光值A2-A1与标准曲线比对，获得待测样品中左旋肉碱浓度，其中，所述左旋肉碱标准工作液是左旋肉碱标准品的水溶液，所述左旋肉碱标准品的浓度分别为1.6μg/ml，3.2μg/ml，6.4μg/ml，9.6μg/ml，16μg/ml，所述显色液中含有0.2mg/ml的2-硝基苯甲酸，23.84mg/ml的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸，0.74mg/ml的乙二胺四乙酸二钠，pH为7.4～7.6，所述乙酰辅酶A溶液是乙酰辅酶A的水溶液，所述乙酰辅酶A的浓度为0.4mg/ml，所述肉碱乙酰转移酶溶液是肉碱乙酰转移酶的水溶液，所述肉碱乙酰转移酶的酶活为15～45units/ml。利用根据本发明实施例的检测左旋肉碱含量的方法，能够快速、准确地检测食品中左旋肉碱含量，检测时间相比于现有技术，缩短到15min左右，检测效率，相比于现有技术，实现了批量检测，检测灵敏度，相比于现有技术，检出限低至0.5mg/100g，定量限低至1.5mg/100g。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在以下实施例1～4中，发明人分别从乙酰辅酶A的浓度、肉碱乙酰转移酶的用量、读数时间、检测波长的角度，对检测左旋肉碱含量的条件进行优化的实验过程。实施例1检测步骤：1.1准确称取5g(精确0.0001g)混合均匀的试样于烧杯中，温水溶解，转入100mL容量瓶中；加10mL10％高氯酸溶液，混合均匀后静置30min。用蒸馏水定容至刻度，混匀，过滤。取滤液20mL，用4mol/L氢氧化钾溶液调pH为12.5～13.0后，置于40℃水浴60min。冷却后用10％高氯酸调pH为7.0～7.5。将样液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容。混匀后置于4℃冰箱中过夜。将试样处理液从冰箱中取出放置至室温，取上清液用0.45μm滤膜过滤后备用。1.2吸取100uL制备好的左旋肉碱标准工作液和试样待测液各三份于96孔微孔板中，按顺序用排枪加入40uL显色工作液和50μL乙酰辅酶A工作液，混合均匀后放入酶标仪样品室中，检测波长调为405nm，5min后进行读数，结果记录为A1(平行样的吸光度平均值)。拿出微孔板，迅速用排枪按顺序加入50μL肉碱乙酰转移酶溶液，混合均匀后放入酶标仪样品室中，反应10min后读数，结果记录为A2(平行样的吸光度平均值)，以左旋肉碱标准工作液的浓度为横坐标，以吸光值A2-A1为纵坐标，制作标准曲线，然后在标准曲线上查得试样待测液的浓度通过计算得出样品中左旋肉碱的含量。左旋肉碱标准储备液(80.52μg/mL)：可根据需要制备不同浓度的标准储备液。左旋肉碱标准工作液：可根据需要制备不同浓度的标准工作液。显色工作液：吸取1.0mL显色储备液用水定容至5mL。乙酰辅酶A工作液：吸取100uL乙酰辅酶A储备液，用水稀释至2.5mL，临用时配置。肉碱乙酰转移酶工作液：吸取100μL乙酰肉碱转移酶悬浮液，用水稀释至4mL，临用时配置。1)、标准曲线的建立：根据检测方法建立标准曲线的原始数据如表1和表2所示。表1：表2左旋肉碱浓度(μg/mL)吸光度A1吸光度A2A2-A11.610.0910.1450.0543.220.0910.1810.0906.440.0910.2490.1589.660.0930.3150.22216.10.0910.4240.333以左旋肉碱浓度为X轴，A2-A1的值为Y轴，做散点图，进而得出标准曲线计算公式为：Y＝0.019X+0.029，曲线相关性为R2＝0.997。2)、根据标准曲线通过计算得到样品的左旋肉碱含量。计算的原始数据如表3和表4所示：表3：表4：3)、回收率验证：在不同日期采用上述方法对样品进行左旋肉碱三水平加标回收率的验证，加标水平分别为8mg/100g、10mg/100g、12mg/100g，其结果如表5所示：序号2016.4.82016.4.28回收率-8mg/100g(％)99.499.2回收率-10mg/100g(％)101.998.4回收率-12mg/100g(％)101.595.54)、检出限：0.5mg/100g，定量限：1.5mg/100g实施例2检测步骤：2.1准确称取5g(精确0.0001g)混合均匀的试样于烧杯中，温水溶解，转入100mL容量瓶中；加10mL10％高氯酸溶液，混合均匀后静置30min。用蒸馏水定容至刻度，混匀，过滤。取滤液20mL，用4mol/L氢氧化钾溶液调pH为12.5～13.0后，置于40℃水浴60min。冷却后用10％高氯酸调pH为7.0～7.5。将样液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容。混匀后置于4℃冰箱中过夜。将试样处理液从冰箱中取出放置至室温，取上清液用0.45μm滤膜过滤后备用。2.2吸取100uL制备好的左旋肉碱标准工作液和试样待测液各三份于96孔微孔板中，按顺序用排枪加入40uL显色工作液和50μL乙酰辅酶A工作液，混合均匀后放入酶标仪样品室中，检测波长调为405nm，5min后进行读数，结果记录为A1(平行样的吸光度平均值)。拿出微孔板，迅速用排枪按顺序加入50μL肉碱乙酰转移酶溶液，混合均匀后放入酶标仪样品室中，反应10min后读数，结果记录为A2(平行样的吸光度平均值)，以左旋肉碱标准工作液的浓度为横坐标，以吸光值A2-A1为纵坐标，制作标准曲线，然后在标准曲线上查得试样待测液的浓度通过计算得出样品中左旋肉碱的含量。左旋肉碱标准储备液(80.52μg/mL)：可根据需要制备不同浓度的标准储备液。左旋肉碱标准工作液：可根据需要制备不同浓度的标准工作液。显色工作液：吸取1.0mL显色储备液用水定容至5mL。乙酰辅酶A工作液：吸取100uL乙酰辅酶A储备液，用水稀释至5mL，临用时配置。肉碱乙酰转移酶工作液：吸取100μL乙酰肉碱转移酶悬浮液，用水稀释至2mL，临用时配置。结果显示，标准曲线的计算公式为：y＝0.0209x+0.0347，曲线相关性为R2＝0.9992样品的检测数据如表5所示。表5：表5结果显示，左旋肉碱转移酶和乙酰辅酶A在实施例2的配比下得到的结果在平行样偏差范围内。实施例3检测步骤：3.1准确称取5g(精确0.0001g)混合均匀的试样于烧杯中，温水溶解，转入100mL容量瓶中；加10mL10％高氯酸溶液，混合均匀后静置30min。用蒸馏水定容至刻度，混匀，过滤。取滤液20mL，用4mol/L氢氧化钾溶液调pH为12.5～13.0后，置于40℃水浴60min。冷却后用10％高氯酸调pH为7.0～7.5。将样液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容。混匀后置于4℃冰箱中过夜。将试样处理液从冰箱中取出放置至室温，取上清液用0.45μm滤膜过滤后备用。3.2吸取100uL制备好的左旋肉碱标准工作液和试样待测液各三份于96孔微孔板中，按顺序用排枪加入40uL显色工作液和50μL乙酰辅酶A工作液，混合均匀后放入酶标仪样品室中，检测波长调为405nm，5min后进行读数，结果记录为A1(平行样的吸光度平均值)。拿出微孔板，迅速用排枪按顺序加入50μL肉碱乙酰转移酶溶液，混合均匀后放入酶标仪样品室中，分别反应7、8、10、13、15、20min后读数，结果记录为A2(平行样的吸光度平均值)，以左旋肉碱标准工作液的浓度为横坐标，以吸光值A2-A1为纵坐标，制作标准曲线，然后在标准曲线上查得试样待测液的浓度通过计算得出样品中左旋肉碱的含量。左旋肉碱标准储备液(80.52μg/mL)：可根据需要制备不同浓度的标准储备液。左旋肉碱标准工作液：可根据需要制备不同浓度的标准工作液。显色工作液：吸取1.0mL显色储备液用水定容至5mL。乙酰辅酶A工作液：吸取100uL乙酰辅酶A储备液，用水稀释至2.5mL，临用时配置。肉碱乙酰转移酶工作液：吸取100μL乙酰肉碱转移酶悬浮液，用水稀释至4mL，临用时配置。在不同时间点读数所得标准曲线的线性方程和所得样品中左旋肉碱的含量如表6所示。表6：计算7-20min的比色结果，与国标法测定的结果之间的相对偏差在10％范围内，但其比色时间在7min、8min时其反应不完全，标准曲线方程线性不好，10min-20min时其标准曲线方程线性较好，但随着时间的增加，其吸光度也有所下降，因此首选10min作为最优比色时间。实施例4在本实施例中，发明人采取450nm的波长作为检测波长进行吸光度的读数，其余条件与实施例1相同，其读数结果如表7所示。表7：通过以上左旋肉碱标准样品的数据做出的标准曲线方程为：y＝0.0131x+0.0083；R2＝0.9984由表7可以看出吸光度A2和A1的差距比较小，这样误差会变大，因此不宜采用450nm作为其吸收波长。根据实施例1～4的条件筛选结果，发明人得出：检测左旋肉碱含量的方法可采用如下步骤：检测步骤：吸取制备好的左旋肉碱标准工作液和试样待测液100uL-150uL(优选100uL)(可吸取平行样2-4个)于96孔微孔板中，按顺序用排枪加入40uL显色工作液和50μL乙酰辅酶A溶液，混合均匀后放入酶标仪样品室中，检测波长调为405nm，5min后进行读数，结果记录为A1(平行样的吸光度平均值)。拿出微孔板，迅速用排枪按顺序加入50μL肉碱乙酰转移酶溶液，混合均匀后放入酶标仪样品室中，反应10-20min(优选10min)后读数，结果记录为A2(平行样的吸光度平均值)，以左旋肉碱标准工作液的浓度为横坐标，以吸光值A2-A1为纵坐标，制作标准曲线，然后在标准曲线上查得试样待测液的浓度通过计算得出样品中左旋肉碱的含量。左旋肉碱标准储备液(80μg/mL)：可根据需要制备不同浓度的标准储备液。左旋肉碱标准工作液：可根据需要制备不同浓度的标准工作液。显色工作液：吸取1.0mL显色储备液用水定容至5mL。乙酰辅酶A工作液：吸取100uL乙酰辅酶A储备液，溶于2.5mL或5mL水中(优选2.5mL)，临用时配置。肉碱乙酰转移酶工作液：吸取100μL肉碱乙酰转移酶悬浮液，溶于2mL或4mL水中(优选4mL)，临用时配置。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页1 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