检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法与流程

本发明属于农业生物技术领域，尤其涉及一种油菜素内酯生物合成基因DWF5突变体的筛选方法。

背景技术：

植物激素在植物细胞内产生的一类极低浓度的活性物质。它们在植物细胞生长分裂、组织器官的分化、开花结实、成熟与衰老、种子休眠与萌发及环境适应与抵抗等方面起着不可或缺的作用，调节着植物生长发育与环境适应的各个方面。近年来，人们通过外源施加生长激素来调控农作物使其高产、高抗、优质获得了重要进展。目前，人们了解和应用得最多的几大类激素包括生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯、油菜素内酯、水杨酸、茉莉酸等。这几大类植物激素都是简单小分子化合物，但其生理效应却十分重要复杂。其中，油菜素内酯发现得较晚，但已广泛应用于作物叶片大小、产量、株高和抗性调节。作为一种甾醇类物质，油菜素内酯作用于植物生长发育和环境适应的各个方面。因此，研究油菜素内酯对于农作物株型调节、高产、高抗等方面具有重要的理论价值和实用意义。

油菜素内酯合成或信号缺失突变体表现出典型的矮小、黑暗中去黄化、推迟开花、雄性不育、根短小等表型(Clouse and Sasse 1998)。突变体的发现加快了油菜素内酯的作用机理研究和广泛应用。自从油菜素内酯受体BRI 1通过诱变获得该基因突变体后，大量BRI 1弱缺失突变体被发现，它们表现出半矮小表型，与强突变体最大的优势是具有可育性，方便进行遗传操作(Li and Chory 1997；Noguchi et al.1999)。比如，bri 1-5是最早发现的bri 1弱突变体，通过甲烷磺酸乙酯(EMS)诱变而得，在油菜素内酯机理研究中应用得最为广泛的弱突变体之一。bri 1-5是BRI 1蛋白胞外结构域半胱氨酸对中第69位氨基酸由酪氨酸取代半胱氨酸而导致(Noguchi et al.1999)。此外，bri1-6、bri1-7、bri1-8、bri1-9是另外几个通过EMS诱变导致氨基酸替换而得的bri1弱突变体(Noguchi et al.1999)。bri1-6是第644位甘氨酸突变成天冬氨酸而致，bri1-7是第613位甘氨酸突变成丝氨酸而致，bri1-8是第983位精氨酸突变成天冬酰胺而致，bri1-9是第622位丝氨酸突变成苯丙氨酸所致。bri1-301是一个由于第989位甘氨酸突变成异亮氨酸而成(Xu et al.2008)。bri1-120是由于第339位丝氨酸突变成苯丙氨酸而致(Shang et al.2011)。

在过去二十年中，科学家们借助模式植物拟南芥中bri 1相关突变体发现了大量BR合成和信号途径中的新成员。例如，用遗传方法筛选bri 1-5的遗传抑制子发现了油菜素内酯信号转导途径中的重要成员BRS1、BAK1、BRL1、BSU1(Li et al.2001；Li et al.2002；Mora-García et al.2004；Zhou et al.2004)。bes1-D作为bri1-119的遗传抑制子被发现(Yin et al.2002)，atbs-D是在br1-301背景下被发现(Wang et al.2009；Kang et al.2010)。通过对bri1-5的遗传抑制子的筛选，人们获得了调控油菜素内酯合成关键限速酶的转录因子TCP1(Guo et al.2010)，以及发现了油菜素内酯分解代谢途径中的关键酶BEN1(Yuan et al.2007)。

目前为止，研究发现油菜素内酯合成途径关键调控酶DET2、DWF4、CPD、CYP90C1/ROT3、CYP90D1、BR6OX2/CYP85A2催化油菜素内酯中间前体物质的转化(Fujioka et al.1997；Choe et al.1998；Kim et al.1998；Shimada et al.2003；Kim et al.2005；Ohnishi et al.2012)。然而，仅有少量弱突变体在模式植物拟南芥中被发现，det2-1在Col背景下得到，是在第二条染色体上32.9位置(position)(Chory et al.1991)，det2-28和det2-101为两个EMS诱变突变体(Li et al.2001；Guo et al.2010)。油菜素内酯合成突变体br6ox2、cyp85a2-1、cyp85a2-2、cyp85a2-3均表现出半矮小表型(Nomura et al.2005)。

然而，由于油菜素内酯合成途径基因突变体的缺乏，有关油菜素内酯合成和信号研究由此变得较为迟缓。因此，构建一些油菜素内酯合成途径关键基因的可育突变体对于油菜素内酯合成和代谢途径的研究及油菜素内酯更为广泛的应用显得非常重要。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明提供一种检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法，该方法能快速检测油菜素内酯主要合成基因突变体的突变体位点。

解决以上技术问题的本发明中的检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)获得突变体植株；

(2)用1μM油菜素内酯喷施突变体，恢复其矮小皱缩表型，则表明该突变体是由于油菜素内酯生物合成基因功能缺失造成。

(3)按照Qiangen公司生产的RNA提取试剂盒及说明书提取总RNA，取2μg总RNA用Invitrogen公司的M-MLV反转录酶按照其说明书进行反转录后得到cDNA；

(4)RT-PCR检测，取100ng总RNA对应的cDNA，用宝生物生产的ExTaq酶按照其说明书进行PCR扩增；若发现油菜素内酯合成途径中关键基因未表达，则为存在突变体。

所述关键基因为dwf5，未表达的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

所述检测方法中包括步骤：提取dwf5-8的基因组DNA，用引物P1和P2扩增得到DNA片段，发现DNA片段长度减小，经测序鉴定后发现dwf5-8中缺失一段DNA序列。

所述引物P1序列为：5’-CATAAAATGGGAGATTGGGAGT-3’

引物P2序列为：5’-CATAGGTGCAACACTTAATCCA-3’。

所述PCR扩增条件如下：95℃，2min；95℃，15s；55℃，30s；72℃,2min，第2至第4步重复29个循环；72℃延伸10min。

所述PCR扩增中引物序列如下：

DWF5-F：5’-ATGACTCGAGCTCTGCTGCTG-3’；

DWF5-R：5’-TCATACGTATATCCCTAAAAC-3’；

以EF1a为内参基因，EF1ɑ-F：5’-CAGGCTGATTGTGCTGTCCT-3’；

EF1ɑ-R：5’-TCAAGTAGCAAAATCA CGGCGCTT-3’。

本发明以拟南芥野生型Col-0为背景材料，将T-DNA pBIB-BASTA(Ge et al.2011)用根癌农杆菌介导的方法转化进入拟南芥Col-0，获得转基因植株，在T2代转基因植株中，发现一株植物出现类似油菜素内酯合成或信号缺失突变体的表型，表现出发育迟缓、莲座宽度变小、植株高度降低、荚果长度减小的表型。经分子生物学手段及遗传学手段鉴定，该突变体植物是由于油菜素内酯合成途径中关键基因DWF5的-1213至376bp区段的缺失所导致，将该突变体命名为dwf5(-8)。

本发明方法从众多基因突变体中筛选到油菜素内酯合成基因，通过该方法能快速鉴定到T-DNA插入导致的基因缺失突变，特别是由于T-DNA插入植物基因组后，T-DNA的丢失而导致其附近基因的功能缺失突变体的鉴定。

对于T-DNA插入植物基因组后由于某种原因T-DNA丢失，但同时使其插入位点附近基因片段随T-DNA一起丢失而导致的基因突变，传统方法中常用图位克隆等方法寻找突变的基因。而本发明中的方法省去了图位克隆等繁琐步骤，结合表型鉴定，本方法能高效检测油菜素内酯重要合成基因突变体的突变位点。

附图说明

图1为本发明中DWF5基因突变体dwf5-8的表型

图2为本发明中采用RT-PCR鉴定野生型拟南芥Col和本发明dwf5-8突变体植物中DWF5基因的表达情况

图3为本发明中dwf5-8突变体缺失区段示意图

图4中中间小的苗是DWF5基因的突变体，后面三颗大苗是DWF5转到小苗后把小苗的表型恢复图

图5为本发明中pBIB-BASTAT-DNA的序列图谱

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述:

实施例1

本发明将DWF5基因突变体dwf5-8的具体构建和检测方法如下：

(1)获得突变体植株：

A、取1μl浓度为10ng/μl的pBIB-BASTA加入到100μl根癌农杆菌中，在电激转化仪上2.4千伏、5毫秒的条件下进行电激转化。在含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml庆大霉素的LB固体培养基上，30℃培养2天生长菌落，待菌落大小为2mm左右进行下一步实验。

电激法为在BIO-RAD电激转化仪上，按照该仪器说明书，在电激转化仪上2.4千伏、5毫秒的条件下进行电激转化。

B、长出的菌落用菌落PCR鉴定后在LB液体培养基中28℃进行扩大培养。

C、参照Clough等(Clough and Bent 1998)的方法用浸花法将pBIB-BASTA T-DNA转化入拟南芥野生型Col-0。

pBIB-BASTA T-DNA的序列图谱如图5。

浸花法操作步骤如下：

(1)农杆菌在LB液体培养基中于28℃培养48小时后，OD600达到0.8时，将农杆菌于6500g离心5min,收集菌体。

(2)将菌体在5％蔗糖溶液中溶解(每100ml农杆菌菌液需200ml 5％蔗糖溶液)，加入0.03％Silwet-L77表面活性剂。

(3)将花蕾浸入上一步液体中轻轻晃动20秒。

(4)浸染后的苗继续生长，收获种子。

D、将T0代种子收集后种于营养土中，待幼苗萌发后一周时用除草剂1.5‰草甘膦溶液喷施后，获得T1代转基因幼苗。

E、收获T1代转基因幼苗的种子，即为T2代种子。

F、丹麦有机水藓基质泥炭土(0-10mm)，待幼苗长出1周后，喷施1.5‰草甘膦溶液进行转基因苗抗性筛选。存活的幼苗中，发现一株苗表现出类似油菜素内酯合成或信号相关基因的突变体，表现出发育迟缓、莲座宽度变小、植株高度降低、荚果长度减小的表型(图1)。

G、通过对油菜素内酯合成和信号途径关键基因的RT-PCR(反转录PCR)用引物DWF5-F(引物序列为5’-ATGACTCGAGCTCTGCTGCTG-3’)和DWF5-R(引物序列为5’-TCATACGTATATCCCTAAAAC-3’)鉴定，以EF1a为内参基因(反转录PCR引物为EF1ɑ-F：5’-CAGGCTGATTGTGCTGTCCT-3’；EF1ɑ-R：5’-TCAAGTAGCAAAATCA CGGCGCTT-3’)发现油菜素内酯合成途径中关键基因DWF5未表达(图2)，将该突变体命名为dwf5-8。

RT-PCR检测步骤具体为对上一步抗除草剂BASTA的幼苗，生长3周后，按照Qiangen公司生产的RNA提取试剂盒及说明书提取总RNA，取2μg总RNA用Invitrogen公司的M-MLV反转录酶按照其说明书进行反转录后得到cDNA，取100ng总RNA对应的cDNA，用宝生物生产的ExTaq酶按照其说明书进行PCR扩增。

PCR扩增条件如下：95℃，2min；95℃，15s；55℃，30s；72℃,2min(第2至第4步重复29个循环)；72℃延伸10min。

从图1可知，与野生型拟南芥Col相比，dwf5-8突变体植物表现出莲座宽度变小、植株高度降低、荚果长度降低，但单个荚果的种子数量变化不显著。从图2中可知DWF5基因在dwf5-8突变体植株中没有表达。该反转录PCR用EF1a作为内参基因。

实施例2

直接从市场上获得突变体植株。

按照Qiangen公司生产的RNA提取试剂盒及说明书提取总RNA，取2μg总RNA用Invitrogen公司的M-MLV反转录酶按照其说明书进行反转录后得到cDNA；

RT-PCR检测，取100ng总RNA对应的cDNA，用宝生物生产的ExTaq酶按照其说明书进行PCR扩增；若发现油菜素内酯合成途径中关键基因未表达，则为存在突变体。

关键基因为dwf5，未表达的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

再提取dwf5-8的基因组DNA，用引物P1和P2扩增得到DNA片段，发现DNA片段长度减小，经测序鉴定后发现dwf5-8中缺失一段DNA序列。

引物P1序列为：5’-CATAAAATGGGAGATTGGGAGT-3’

P2序列为：5’-CATAGGTGCAACACTTAATCCA-3’。

PCR扩增条件如下：95℃，2min；95℃，15s；55℃，30s；72℃,2min，第2至第4步重复29个循环；72℃延伸10min。

提取dwf5-8的基因组DNA，用引物P1和P2扩增得到DNA片段，发现DNA片段长度减小，经测序鉴定后发现dwf5-8中缺失一段DNA序列，如SEQ ID NO:1所示。

引物P1序列为：5’-CATAAAATGGGAGATTGGGAGT-3’

引物P2序列为：5’-CATAGGTGCAACACTTAATCCA-3’

PCR扩增条件如下：

95℃，2min；95℃，15s；55℃，30s；72℃,2min(第2至第4步重复29个循环)；72℃延伸10min。

由上述实验结果可知，dwf5-8突变体植物中DWF5基因的缺失区段如图3所示。

从这些缺失区段可以证明该方法找到了DWF5基因突变体所缺失的基因片段，即成功获得本发明所期望得到的在该突变体总具体基因缺失区段附近详细信息。

试验一将DWF5这个基因补充回去发现可以恢复dwf5突变体矮小的表型证明的确是DWF5这个基因突变引起。

具体步骤：(1)扩增DWF5CDS全长，构建成pBIB-BASTA-35S-DWF5超表达载体。

(2)用电激法转化到农杆菌中。

(3)用浸花法将含有pBIB-BASTA-35S-DWF5的农杆菌转化到拟南芥dwf5-8中,可以将其矮小表型恢复。

结果如图4，中间小的苗是DWF5基因的突变体，后面三颗大苗是DWF5转到小苗后，把小苗的表型恢复图。

油菜素内酯的合成信号通路已很清晰，传统的方法是用TAIL-PCR等从全基因组寻找某基因的突变位点，本方法是直接检测油菜素内酯合成相关基因的表达，从而定位于合成途径中的某基因，再通过分段检测基因序列的方法而快速确定基因突变位点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1589

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223>dwf5未表达的基因序列

<400> 1

aagtgtattaaacactaaaatcaaaaaaaggaaacaagtcatgtaccatctggacagaaatgaagatgaaggcatgatctctagcaaccagcagctgaaatctcaatctcaaccaccatctatcagcaggcacattggctcggagtttgaaaaaggctctacactctgtacaatgcgaaaatgcaaaaccttcctgaaacatatattgcatagaaacaaaatacacttcataagctaagtaaaccattcattcaaaagaagaagaaactttctggaaacggtgacgataatataccttggtggagcgccaattatcgagacaagatctgtgaacgtgcttttgagtacctttacaattgcacggagcaatcagatcttcccctgcaatcaaagaacaaaccaagtcgtctcattgtatcctcactcaattgagttaaggaattgcttttattatacctccaacatcaaggcaaattcgacattgtggttgatctccagaaacaagaagtgtggtttcgtcatcatcagtctcagctatttctgaaacttgtccttcctccacaacacgatctcctctttccgctgctacgatttcgtttgaggatgttgattcgtcgaataaaatctgttcctttctatcatcatcatcatcactaggcactaattgcatctcttaaacatactaaaatttctggaaatgaaaaaaaactgagaaacgcaaaagaattcaacacagcatcagaaaactagatctaggtttcgccgggagttaccaaaaacattagaaaaaatcgatacttacacgaattcaaccaattctggagaattttcttccaaggcaagccattgcttgcgagttagaagaaattggtaaactatgactgcgaatcagagtgaagagaatttgattttgttagtctcgattcatcactatgtgttgaatacagagatgacgaagatcttttgagggttgagagagaagaagctaagaagattgggatcaatcaaaaacgatggcgaagaaaagtctcaagggtaaaattggaattagaaaaaacatgtggagagcacgtgacacgtgggatttatctgagtttcacagtagacctgtgaagttcatcgtcttcatcgttaacttcgcagactctgttgattagtcaacacagatcagaatctgaggctttggccgagacgagagaagcagaagaagaaaatggcggagactgtacattctccgatcgttacttacgcatcgatgttatcgcttctcgccttctgtccacctttcgtcattctcctgtaagctcatcaatttctgattcgcaagtctttattctagttctcagatcagactcgcacacttttctggctccttaattcatagcgagaagtgcatagccgatatctttaaatcctttcccattaagtaggacttgataagagtctttaattgaaaaagcgattcaatgattctttctctggccaatgtgagtttccagatttttaggaaacaagggtagatttaaagctacaaaatcatatttagtgagttttaagtaatgctcacaagtttcatttctttatgatgc 1589

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