一种鉴定鸡白痢沙门菌的PCR检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种鉴定鸡白痢沙门菌的PCR检测试剂盒。

背景技术：

鸡白痢沙门菌是鸡的重要病原菌，能够感染各种日龄鸡，多侵害20日龄以内幼雏，引起白色下痢，发病率和致死率极高；对日龄较大的青年鸡也可致病和致死；对于成年鸡主要感染其生殖器官，成年鸡可带菌而无临床症状，表现为慢性局部炎症，常导致母鸡体重下降、产蛋减少、患上痢疾、生殖道畸形等；该菌可以通过输卵管进入受精卵，从而造成垂直传播，所产蛋的孵化率和出雏率也明显降低。目前，在西方发达国家该病已经被消灭或基本消灭，偶尔在个别小的禽群中仍有发生，但是在包括中国在内的发展中国家仍然是重要的传染病，所造成的危害和经济损失巨大。

鸡白痢沙门菌的鉴定主要是通过细菌分离、血清型鉴定、生化鉴定等传统方法，但是传统方法费时费力，尤其是鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌血清型时常难以区分。因此，迫切需要一种快速、准确、简便的细菌鉴定方法。建立一种能够快速鉴定鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的检测方法具有重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速、准确、高灵敏地鉴定鸡白痢沙门菌的PCR检测试剂盒及其制备和应用。

为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种鉴定鸡白痢沙门菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括ipaJ基因检测引物，所述ipaJ基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

本发明的试剂盒采用PCR检测技术进行ipaJ基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断检测对象是否属于鸡白痢沙门菌。因此，引物的设计是本发明试剂盒的关键。

基于本发明所述试剂盒是采用PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：无菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。

所述PCR检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR检测液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有无菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶。加入本发明的引物、待检样本DNA提取物或者样本菌液即可获得PCR反应体系。

优选地，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有鸡白痢沙门菌ipaJ基因表达的DNA样本。

优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为不含有鸡白痢沙门菌ipaJ基因表达的DNA样本。

本发明的第二方面，提供了前述鉴定鸡白痢沙门菌的PCR检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述ipaJ基因检测引物；

(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；

(4)PCR反应结束后，分析结果。

优选地，所述方法为非疾病诊断目的的方法。

步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。

优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：94℃预变性3min,再进行如下循环：94℃30sec，62℃40sec，72℃50sec，30个循环，最后72℃延伸10min。

本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备ipaJ基因检测产品中的用途。

优选地，所述检测产品用于检测和筛选鸡白痢沙门菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的鉴定鸡白痢沙门菌的PCR检测试剂盒，以鸡白痢沙门菌ipaJ基因为靶基因，使用一对特异性引物PCR扩增检测鸡白痢沙门菌。本发明提取样品DNA后仅需PCR扩增以及凝胶电泳便可得出检测结果，较经典方法的细菌分离、血清型鉴定、生化鉴定更加简便，具有操作简单，检测时间短，特异性强，准确度高，灵敏度高，并且能够准确区分鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌，适用范围广等优点，可替代传统的鸡白痢沙门菌的检测方法。

附图说明

图1A：ipaJ基因在鸡白痢沙门菌分离株的PCR结果，其中1～23分别是：C79-13、6201、6202、6210、6504、6508、6509、6703、6710、6702、6803、7102、S9720X、S97222、S97244、S97262、S97289、S97377、S97323、2095/85、B8604、B8605、B8607的检测结果。

图1B：ipaJ基因在鸡白痢沙门菌分离株的PCR结果，其中24～47分别是B8611、2872/86、S188/86、449/87、S9303、S9404、S98116、S9804、S98109、S9835、S9847、S9876、S9886、660/98、S9833、S9881、S9852、380/99、790/01、S03021、S04021、S0504、S06004、S06013的检测结果。

图1C：ipaJ基因在鸡白痢沙门菌分离株的PCR结果，其中48～69分别是SLH30、S07023、S08018、S08024、S08026、S08044、S081014C16、S081014C19、S081014C7S08008、S08029、S090418zyqC12、S090418zyqC13、S090418zyqC15、S090414zyqC4、S090418zyqC6、S090418zyqC10、1204、1211、1213、1215、1306、1314的检测结果。

图1D：ipaJ基因在鸡白痢沙门菌分离株的PCR结果，其中70～79分别为1320、1331、20-23、20-56、13-82、17-30、20-69、17-70以及13-62的检测结果。

图2：ipaJ基因在其它血清型沙门菌分离株的PCR结果，其中1～22分别是血清型(英文名)：S.Paratyphi A、S.Typhimurium、S.Indiana、S.Choleraesuis、S.Infantis、S.Rissen、S.Hadar、S.Goldcoast、S.Istanbul、S.Albany、S.Gallinarum、S.Enteritidis、S.Ughelli、S.Anatum、S.London、S.Meleagridis、S.Calabar、S.Senftenberg、S.Sao、S.Nanga、S.Worthington和S.Aberdeen的检测结果。

图3：ipaJ基因检测鸡白痢沙门菌的灵敏性的PCR结果，其中1～8分别是C79-13基因组(热裂解法提取)稀释10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶以及10⁷后的检测结果。

图4：ipaJ基因检测鸡白痢沙门菌的灵敏性的PCR结果，其中1～10分别是C79-13基因组(试剂盒法提取)浓度为：45ng/μL、4.5ng/μL、0.45ng/μL、45pg/μL、4.5pg/μL、0.45pg/μL、45fg/μL、4.5fg/μL、0.45fg/μL和45ag/μL时的检测结果。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等

MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1试剂盒的制备

引物设计与合成：在GenBank中搜索鸡白痢沙门菌的ipaJ基因序列。参照GenBank中鸡白痢沙门菌标准株S06004中pSPI12质粒上ipaJ序列(Genomic Sequence:NC_019102.1)设计引物。使用Primer Premier 5.0软件按照默认设定进行设计。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司按照PAGE纯度级别合成。

引物的核苷酸序列如下表1所示：

表1

上述引物对可单独包装，也可以配成PCR检测液。所述PCR检测液中，上述引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。

也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。

进一步地，所述试剂盒还可以含有无菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂等等。

实施例2试剂盒检测鸡白痢沙门菌的特异性

采用实施例2所述试剂盒中的引物，应用已知鸡白痢沙门菌或非鸡白痢沙门菌(表1和表2)测试本发明的试剂盒基于ipaJ为靶基因的PCR扩增技术检测鸡白痢沙门菌的特异性。

表1实验中使用的鸡白痢沙门菌

表2实验中使用的非鸡白痢沙门菌

将本实验室冻干保存的上世纪60、70、80、90年代分离的鸡白痢沙门菌分离株以及国外实验室馈赠的几十株鸡白痢沙门菌用LB固体平板复苏，分别挑取单菌落接种于液体LB培养基中，37℃，180r/min振摇培养12-14h，作为样品。

所述的样品，待检时，采用热裂解法提取基因组DNA，具体步骤如下：取在液体LB中过夜培养的细菌菌液1mL，12000rpm离心1min收集细菌沉淀，沉淀用200μL的超纯水洗涤两遍后，继续用200μL的超纯水悬浮，沸水浴10min。12000rpm离心5min，取上清作为PCR检测的模板。用本发明的试剂盒进行检测。

PCR反应体系为(25μL)：ddH₂O 16.25μL，dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，ipaJ F1μL，ipaJ R 1μL，模板2μL，rTaq酶0.25μL。

PCR程序为：94℃预变性3min,再进行如下循环：94℃30sec，62℃40sec，72℃50sec，30个循环，最后72℃延伸10min。

接着对PCR扩增产物进行鉴定：取PCR扩增产物5μl，点样于10g/L琼脂糖凝胶(含0.3mg/L溴化乙锭)，以DL2000Marker作为标准分子参照，以5V/cm的电场强度于1×TAE电泳缓冲液中电泳1h，紫外线下观察产物，凝胶成像系统拍照。存在741bp的特异性条带时，样品为鸡白痢沙门菌阳性，否则为鸡白痢沙门菌阴性。

结果显示，实验室从1962-2014年分离的79株鸡白痢沙门菌全部被检测为阳性(图1A～图1D所示)，22株非鸡白痢沙门菌判定为阴性(如图2所示)。结果表明，以ipaJ为靶基因的PCR扩增检测鸡白痢沙门菌技术具有高度特异性。

在本实施例中，采用传统细菌分离、血清型鉴定、生化鉴定的方法，将上述101株沙门菌中的79株鸡白痢沙门菌筛选出来，需要至少2天的时间。而采用本发明实施例2的检测试剂盒，仅需3个小时，即可将上述101株沙门菌中的79株鸡白痢沙门菌筛选出来，且正确率为100％。

实施例4试剂盒检测鸡白痢沙门菌的灵敏性(敏感性)

选取鸡白痢沙门菌C79-13作为检测鸡白痢沙门菌灵敏性的菌株。

挑取C79-13单菌落接种于LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床180rpm振荡培养12小时。

(1)采取热裂解法提取C79-13菌株的基因组后，将其进行倍比稀释，分别取2μL作为反应模板(分别含有100％，10％，1％，0.1％，0.01％，0.001％，0.0001％，0.00001％的C79-13基因组DNA)进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行鉴定。

结果显示，将基因组进行10⁶倍稀释后，由图3可以看出，PCR扩增后仍能检测出特异性条带。

(2)按照北京天根生物技术有限公司细菌基因组提取试剂盒操作说明书提取鸡白痢沙门菌C79-13的全基因组。获得的基因组浓度为450ng/μL，将其倍比稀释十个梯度，使得其终浓度分别为：45ng/μL、4.5ng/μL、0.45ng/μL、45pg/μL、4.5pg/μL、0.45pg/μL、45fg/μL、4.5fg/μL、0.45fg/μL、45ag/μL。各取2μL作为PCR扩增反应的模板，并对PCR扩增产物进行鉴定。

结果如图4显示，在基因组浓度为0.45fg/μL时，进行PCR扩增后仍能检测到特异性片段。亦即，本发明试剂盒的检测限低达0.45fg/μL。这充分说明了利用PCR扩增ipaJ基因检测鸡白痢沙门菌的高度敏感性。

综上所述，本发明试剂盒相较于传统血清型鉴定方法的优势：

传统血清型鉴定需购买特定的沙门菌血清型鉴定试剂盒，价格昂贵，步骤繁琐，尤其在大样本中分离特定的血清型沙门菌(如鸡白痢沙门菌)时，需耗费大量时间(至少两天)，且工作量庞大，其结果是由肉眼进行判断，因而可能存在人为误差；而本发明试剂盒的检测方法操作简单，成本非常低，且对细菌的存在形式没有要求(单菌落、冻存菌液或新鲜菌液均可)，整个鉴定过程在三小时内即可完成(包含PCR和琼脂糖凝胶电泳)，且准确率达到100％。

因此，本发明的一种鉴定鸡白痢沙门菌的PCR检测试剂盒，有利于简化沙门菌血清型鉴定的传统步骤，为在大量样本中筛选鸡白痢提供了一种快速鉴定的新方法。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

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