检测肝豆状核变性ATP7B基因的引物组合和方法与流程

本发明属于生物科学领域，涉及肝豆状核变性ATP7B基因的检测。

背景技术：

肝豆状核变性(又称Wilson病，WD)，是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍疾病，可引起铜蓝蛋白合成障碍、胆汁中铜排泄受阻，过量的铜不能排出体外而在体内沉积，导致肝硬化、神经症状、角膜K-F环、尿铜升高等临床表现。该疾病的发病与铜转运相关的P型ATP酶(即ATP7B蛋白)功能改变相关。ATP7B蛋白的编码基因被定位在13q14.3上，包含21个外显子和20个内含子，编码1465个氨基酸。ATP7B基因的突变表现为少数几个热点突变为主，伴有广泛存在的散在突变。国内外、国内不同地区、民族间主要热点突变都存在一定的差异。目前研究表明，亚洲人的突变热点为Arg778Leu，中国人群中该突变热点的发病率也占约70％。由于该疾病为一种隐形遗传疾病，发病有一定的隐蔽性，对未有表型的人群进行该基因检测将有助于判断疾病的发生概率，在产前诊断中将有格外显著的意义。

现有技术中已有大量的检测ATP7B基因的试剂，如PCR检测试剂。这些试剂的效果各有差异，导致对疾病的诊断出现不同的结果。因此，本领域中依然存在寻找有效的检测试剂的需求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供ATP7B基因的检测试剂，使得可以便捷地检测中国人群中的ATP7B基因突变，从而提早诊断是否存在肝豆状核变性。

在第一个方面，本发明提供检测ATP7B基因的引物组合，所述引物组合包括：

引物对1：

正向引物F1：gaactctcctccctacttgctgg(SEQ ID NO:1)；

反向引物R1：aacatggtgttcagagaagtg(SEQ ID NO:2)；

引物对2：

正向引物F2：gtgaagagttctgggaaatcag(SEQ ID NO:3)；

反向引物R2：cacaaccaccatatagcccaag(SEQ ID NO:4)。

进一步优选地，所述引物组合还包括：

引物对3：

正向引物F3：gacaatgaaccctcaccaagagc(SEQ ID NO:5)；

反向引物R3：cgaggtctatacgcagcattcc(SEQ ID NO:6)；

引物对4：

正向引物F4：gagtggcttgtaatccaggtgac(SEQ ID NO:7)；

反向引物R4：gccacacacagcatggaagggag(SEQ ID NO:8)；

引物对5：

正向引物F5：ctgcctcaggagtgtgactatg(SEQ ID NO:9)；

反向引物R5：cacgcccaagtccacgtacctc(SEQ ID NO:10)；

引物对6：

正向引物F6：ggaccatttagaaataaccacagc(SEQ ID NO:11)；

反向引物R6：ctgagagagcggaaggaaggcag(SEQ ID NO:12)。

在第二个方面，本发明提供一种检测ATP7B基因的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物组合。

优选地，所述试剂盒还包括用于PCR反应的试剂，如Taq酶、dNTP、Taq酶缓冲液等。

在第三个方面，本发明提供一种检测ATP7B基因突变的方法，所述方法包括使用本发明的引物组合对基因组进行扩增，并将扩增结果与野生型ATP7B基因组进行比较。

优选地，所述检测过程中，退火过程为：以52℃，退火30秒；再以48℃，退火30秒。

本发明提供的引物组合对ATP7B的外显子3、7、8、12、14和16进行了扩增，这些扩增区域覆盖了中国人的90％的已知的与肝豆状核变性相关的ATP7B基因突变类型，有效检测肝豆状核变性的可能性。其中外显子8和12中突变发生的频率最高，以这两个外显子的引物组合进行检测可以筛查出70％的突变可能性。本发明的引物组合与染色体的结合性好，扩增灵敏度高，检测的准确率高；并且本发明的这些引物对可以以相同的程序进行退火反应，节省了检测操作程序，提高效率。

附图说明

图1：外显子8扩增产物；

图2：外显子12扩增产物；

图3：外显子3扩增产物；

图4：外显子7扩增产物；

图5：外显子14扩增产物；

图6：外显子16扩增产物；

各图中，marker从上到下分别表示1000、700、500、400、300、200和100bp，泳道1～4分别表示退火温度为48℃、50℃、52℃以及52℃和48℃组合的扩增结果。

具体实施方式

以下将结合具体实施方式说明本发明，但本发明的内容不限于此。如果没有其它明确说明，以下具体实施例中所使用的方法均是本领域常规技术方法，本领域技术人员完全知道如何实现这些方法并获得相应的结果；所使用的试剂和仪器都是常规试剂和仪器，可以从普通的商购途径中获得。

实施例1：PCR引物的设计

根据ATP7B基因组序列(参见NG_008806.1)，针对中国人突变高发外显子3、7、8、12、14和16设计引物并进行验证试验。引物设计原则根据《分子克隆实验指南第三版》的要求设计，同时还要兼顾不同引物对之间的二级结构和结合可能性，以及各引物对的退火温度。设计的各外显子对应的引物和反应温度分别如表1所示：

表1：外显子及其对应的引物序列

其中，F代表正向引物，R代表反向引物。

实施例2：引物扩增效果验证

取已鉴定为正常ATP7B基因的血液样本进行效果验证，血液样本按照常规的处理方式处理，以用于PCR反应。

按照表2的反应体系配制反应液，每个外显子各2管，分别为实验组和阴性对照组，其中阴性对照组的模板为水。

表2：反应体系

由于各引物对的退火温度不一，分别设置几个退火温度进行验证，包括48℃、50℃、52℃以及52℃和48℃组合。具体程序为：95℃5min，(95℃1min，退火1min(其中52℃和48℃组合的退火方式为52℃30s然后48℃30s)，72℃1min)40个循环，72℃延伸3min。

获得的产物通过PCR电泳以及测序验证PCR引物效果。根据图1～图6的结果显示，本发明的6对引物均能够特异性地扩增出目标条带，扩增结果正确(阴性实验结果未示出)。每对引物在各自的退火温度下均有最好的结果；然而52℃和48℃组合的退火程序对于每对引物而言，其结果与各自确定的退火温度的结果几乎一样。为方便实验，将采用组合退火温度的方式进行检测。

实施例3：PCR引物扩增检测肝豆状核变性病人的ATP7B基因

从临床收集已确定突变型的肝豆状核变性病人样本和正常样本共109例，利用PCR方法使用实施例1中的引物进行扩增。扩增的体系和条件如实施例2所示，采用组合退火温度退火。对扩增后的产物进行序列分析和比对，检测是否存在基因变异。

实验结果显示，利用本发明的引物进行扩增，从109例样本中发现了38例Arg778Leu突变、10例Pro992Leu突变、2例Arg952Lys突变和1例Arg919Gly突变。这个结果与已确定的结果一致，说明本发明的PCR引物能够有效检测ATP7B基因突变，准确率高。并且这几个外显子以相同的程序进行检测，有效提高了扩增效率，节省检测时间。

序列表

<110> 中国人民解放军第四军医大学第一附属医院

<120> 检测肝豆状核变性ATP7B基因的引物组合和方法

<130> Y161265-OI

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物F1

<400> 1

gaactctcct ccctacttgc tgg 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物R1

<400> 2

aacatggtgt tcagagaagt g 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物F2

<400> 3

gtgaagagtt ctgggaaatc ag 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物R2

<400> 4

cacaaccacc atatagccca ag 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物F3

<400> 5

gacaatgaac cctcaccaag agc 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物R3

<400> 6

cgaggtctat acgcagcatt cc 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物F4

<400> 7

gagtggcttg taatccaggt gac 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物R4

<400> 8

gccacacaca gcatggaagg gag 23

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物F5

<400> 9

ctgcctcagg agtgtgacta tg 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物R5

<400> 10

cacgcccaag tccacgtacc tc 22

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物F6

<400> 11

ggaccattta gaaataacca cagc 24

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物R6

<400> 12

ctgagagagc ggaaggaagg cag 23