一种用于检测TNF‑a基因SNP位点rs1799724基因型的扩增引物、试剂盒、方法及其应用与流程

本发明属于基因检测领域，具体来说是一种用于检测tnf-a基因snp位点rs1799724基因型的扩增引物、试剂盒、方法及其应用。

背景技术：

强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis,as)是一种常见的慢性炎症性风湿性疾病，主要侵犯人体中轴骨关节系统以及外周大关节，特征性病理改变是肌腱和韧带附着点的慢性炎症，多见于10～40岁的青壮年，20-30岁为发病高峰。一般男性发病较早，病情较重，是导致青壮年致残和丧失劳动力的重要病因之一。

研究表明tnf-α基因启动子转录调控元件位于基因上游-863位点至-857位点之间，在此区域单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,snps)差异可能与tnf-α基本表达相关，而tnf-α基因表达可能与tnf-α拮抗剂的治疗的有效性相关。已有研究表明rs1799724(-857c/t)单核苷酸多态性与as有显着关联,-857t是中国南方人群as发病的危险因素，-857tt纯合子较ct杂合子对tnf-a拮抗剂6周治疗后的as病人的炎症指标、basfi改善更显著，因此，有效的确定tnf-a基因snp位点rs1799724基因型很有必要。

近年来，随着tnf–α拮抗剂在临床上的应用，可使临床症得到as状迅速缓解，然而此类制剂费用昂贵，部分患者初次治疗，临床疗效不佳甚至无反应，而且接受治疗的患者有出现结核、真菌、细菌感染等并发症的风险。因此，寻找能预测as患者对tnf-α拮抗剂治疗有效性的标志物显得十分重要。

技术实现要素：

为解决上述提出问题，本发明提供一种如下的技术方案：

一种用于检测tnf-a基因snp位点rs1799724基因型的扩增引物，所述的扩增引物的序列为：

正向引物primer-f：cagcaatgggtaggaga；

反向引物primer-r：cttctcagggccccag。

一种用于检测tnf-a基因snp位点rs1799724基因型的试剂盒，所述的试剂盒包括有上述的引物对和特异探针，所述的特异探针序列probe-c：ccccttaacgaagacag，序列5’段使用fam标记，3’端用mgb标记；特异探针序列probe-t:ccccttaatgaagacag,序列5’段使用vic标记，3’端用mgb标记。

一种检测tnf-a基因snp位点rs1799724基因型的方法，所述的方法包括如下步骤：

1)、提取待测样本的外周血基因组dna；

2)、pcr扩增：所使用的扩增引物序列为：正向引物primer-f：cagcaatgggtaggaga，反向引物primer-r：cttctcagggccccag；特异探针序列probe-c：ccccttaacgaagacag，其中序列5’段使用fam标记，3’端用mgb标记，特异探针序列probe-t:ccccttaatgaagacag,其中序列5’段使用vic标记，3’端用mgb标记；

pcr扩增反应组分：

扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火20s；65℃延伸40s；40个循环；

4)、荧光信号的收集：选择fam和vic，数据的采集定在65℃；

5)、通过收集的fam和vic的荧光信号进行结果分析，对基因型进行判定。

进一步的，步骤5)中的判定方法为：进行allelicdiscrimination(等位基因的检测)分析，x轴为allele1信号,y轴为allele2，进行散点图判读：

如果位置靠近x轴，判读为cc样品为cc型；

如果位置靠近y轴，判读为tt样品为tt型；

如果位置靠近对角线，判读为ct样品为ct型。

进一步的，步骤5)中的判定方法为采用曲线分析判读：

如果只有一条扩增曲线，判读为cc或者tt型；

如果有2条扩增曲线，判读为ct样品为ct型；

如果无扩增曲线，样本基因型无法判读，需要重新检测。

一种检测tnf-a基因snp位点rs1799724基因型的应用，通过检测tnf-a基因snp位点rs1799724基因型预测as患者对tnf-α拮抗剂的治疗有效性。

本发明的有益效果在于：创新性地检测tnf-a基因snp位点rs1799724(-857c/t)基因型，使用荧光定量pcr技术，对tnf-a基因的rs1799724突变位点，设计pcr引物和探针进行基因型检测，灵敏度高，特异性好，检测迅速；利用标记荧光的探针能和模板特异性结合，根据特异结合的探针类型，pcr反应时可以产生对应的荧光信号的原理，通过荧光信号类型分辨不同样本的基因型，应用本发明对tnf-a基因snp位点rs1799724基因型的分型与测序结果完全一致，能够用于as患者tnf-a拮抗剂治疗效果的预测。

附图说明

图1为rs1799724基因分型散点图结果判读模式；

图2为rs1799724基因分型扩增曲线结果判读模式。

具体实施方式

一、样本dna提取质检

使用常规的血液dna提取试剂盒进行样本提取：样本满足10-100ng/μl、纯度od260/280＝1.7-2.0。

二、pcr扩增

所使用的扩增引物序列为：正向引物primer-f：cagcaatgggtaggaga；反向引物primer-r：cttctcagggccccag。特异探针序列probe-c：ccccttaacgaagacag，序列5’段使用fam标记，3’端用mgb标记；特异探针序列probe-t:ccccttaatgaagacag,序列5’段使用vic标记，3’端用mgb标记。

pcr扩增反应组分：

3.pcr扩增(在pcr扩增区进行)

将上述20μlpcr反应管放入荧光定量pcr仪(abi7500)中，设置扩增程序如下：

荧光信号的收集选择fam和vic，数据的采集定在65℃。

三、检测结果的解释

扩增反应完成后，通过收集的fam和vic的荧光信号进行结果分析，abi荧光pcr仪进行allelicdiscrimination分析，x轴为allele1信号,y轴为allele2。

请参照图1，以下以allele1是设置为fam(代表基因c)，allele2是设置为vic(代表基因t)为例分析。按照上述设置在基因分型散点图中，cc型样本聚集在靠近x轴位置，tt型样本聚集在靠近y轴位置，ct型样本聚集在x和y轴靠近对角线位置，阴性对照靠近原点。

(1)、散点图判读

1.位置靠近x轴，结果判读为cc样品为cc型(纯和突变)；

2.位置靠近y轴，结果判读为tt样品为tt型(野生型)；

3.位置靠近对角线，结果判读为ct样品为ct型(杂合突变)；

(2)、amplificationplot模式判读

如果只有一条扩增曲线，根据设置的allele，结果判读为cc或者tt型(纯合样本)；如果有2条扩增曲线，结果判读为ct样品为ct型(杂合突变)；如果无扩增曲线，样本基因型无法判读，需要重新检测(图2为组合图)。