本发明涉及生物检测领域，特别一种同时检测nudt15和ugt1a1基因多位点突变的试剂盒。
背景技术：
：骨髓抑制，是化疗过程中常见的毒性反应，使周围血细胞数量减少,血细胞由多种成分组成,每一种成分都对人体起着不可缺少的作用,任何一种成分的减少都使机体产生相应的副反应。严重的威胁着患者的生命安全和生存质量。巯嘌呤类药物(如常见的咪唑硫嘌呤及6-巯基嘌呤)，广泛地应用在自身免疫疾病，器官移植及炎症疾病上。伊立替康是广谱的抗肿瘤药，现已用于胃癌、结直肠癌、肺癌等实体肿瘤的治疗。此两种化疗药物均可引起骨髓抑制。但出现骨髓抑制的概率及严重程度，在不同的个体上差异很大。国外试验研究发现，含有ugt1a1*28及ugt1a1*6的纯合子或杂合子基因型个体应用伊立替康后，出现骨髓抑制和ⅲ～ⅳ度腹泻的风险更大。在在治疗白血病和克罗恩病中，突变型的nudt15的患者在使用巯嘌呤类药物后出现的骨髓抑制比野生型患者高出88倍。故而使用巯基嘌呤类药物及伊立替康前进行基因检测很有必要，能够更加安全有效地指导用药。目前，在市面上，没有能够同时检测ugt1a1和nudt15的产品，因此发明一种可以同时检测两种基因多态性的试剂盒是十分有必要的。技术实现要素：本发明的目的在于公开了一种同时检测nudt15和ugt1a1基因多位点突变的试剂盒。本发明所采取的技术方案是：一种可同时检测基因多位点突变的试剂盒，试剂盒含有检测nudt15基因多态性和ugt1a1基因多态性的引物。优选的，ugt1a1基因多态性位点为ugt1a1*28、ugt1a1*6。优选的，检测ugt1a1*28基因位点的引物是：正向引物：5’-aacattaacttggtgtatcgattggt-3’(seqidno：1)；反向引物：5’-agcaggcccaggacaagt-3’(seqidno：2)；野生型探针序列是：tgccatatatatatatataagtaggaa(seqidno：3)；突变体探针序列是：tgccatatatatatatatataagtaggaa(seqidno：4)。优选的，检测ugt1a1*6基因位点的引物是：正向引物：5’-cagtcaaacattaacttggtgtatcg-3’(seqidno：5)；反向引物：5’-ctttgctcctgccagaggttcg-3’(seqidno：6)；野生型探针序列是：tagcacctgacgcctcgttg(seqidno：7)；突变体探针序列是：tctttcacatcctccctttggg(seqidno：8)。优选的，检测nudt15基因的引物是：正向引物：5’-ccaccagatggttcagatcttg-3’(seqidno：9)；反向引物：5’-tgggttccttgggaagaactac-3’(seqidno：10)；野生型探针序列是：caacgcagtccct(seqidno：11)；突变体探针序列是：caacacagtcccct(seqidno：12)。优选的，野生型探针有发光基团和猝灭基团；其中发光基团为fam，猝灭基团为mgb。优选的，突变体探针有发光基团和猝灭基团；其中发光基团为vic，猝灭基团为mgb。试剂盒在制备治疗癌症药物中的应用。本发明的有益效果是：该试剂盒可以同时基因多态性位点nudt15、ugt1a1*28、ugt1a1*6，操作简单方便，克服了不同基因位点间的下相互之间的干扰问题，并且这种试剂盒具有检测灵敏度高、效果好的优点。具体实施方式实施例1：引物及探针的设计：设计ugt1a1*6、ugt1a1*28、nudt15基因多位点的特异性引物对与探针，具体如下：实施例2：用实施例1的引物，按以下体系配制反应液，并检测人外周抗凝血提取的dna，再用直接测序法进行验证。反应液的配制：组分ugt1a1*6ugt1a1*28nudt15引物300nm300nm300nm探针200nm200nm1000nmqpcrmix20％v/v20％v/v20％v/v纯化水余量余量余量将提取出的基因组dna溶解于te缓冲溶液中，经紫外分光光度计测定浓度，配成100ng/μl的溶液，作为pcr扩增模板。取18μl反应液加入2μl模板，上机检测，结果如下：nudt15ugt1a1*6ugt1a1*28、分型杂合野生野生ct值26.1227.7628.50测序结果杂合野生野生本发明的检测结果与直接测序结果一致，ct值小于35，分型正确。实施例3用实施例1的引物，按以下体系配制反应液，并检测人外周抗凝血提取的dna，再用直接测序法进行验证。反应液的配制：组分ugt1a1*6ugt1a1*28nudt15引物800nm800nm800nm探针600nm600nm500nmqpcrmix50％v/v50％v/v50％v/v纯化水余量余量余量将提取出的基因组dna溶解于te缓冲溶液中，经紫外分光光度计测定浓度，配成100ng/μl的溶液，作为pcr扩增模板。取18μl反应液加入2μl模板(样本，阳性对照，阴性对照)，上机检测，结果如下：nudt15ugt1a1*6ugt1a1*28、分型野生野生野生ct值18.1323.9126.01测序结果野生野生野生本发明的检测结果与直接测序结果一致，ct值小于35，分型正确。实施例4用实施例1所配制的组分，按以下体系配制反应液，并按下述程序检测人外周抗凝血样本3，再用直接测序法进行验证。反应液的配制：组分ugt1a1*6ugt1a1*28nudt15引物500nm500nm400nm探针200nm200nm200nmqpcrmix40％v/v40％v/v40％v/v纯化水余量余量余量将提取出的基因组dna溶解于te缓冲溶液中，经紫外分光光度计测定浓度，配成100ng/μl的溶液，作为pcr扩增模板。取18μl反应液加入2μl模板(样本，阳性对照，阴性对照)，上机检测，结果如下：本发明的检测结果与直接测序结果一致，ct值小于35，分型正确，特异型好，准确性高。实施例5：以不同浓度(高：106copies/μl、中：105copies/μl、低：104copies/μl)的杂合质粒为模板，用本发明与现有其他的引物及探针作对比(对比例中ugt1a1为市售的试剂盒中的引物探针，nudt15为本公司设计的其他引物及探针)。按相同的体系及程序进行扩增。体系如下：组分ugt1a1*6ugt1a1*28nudt15引物500nm500nm400nm探针200nm200nm200nmqpcrmix40％v/v40％v/v40％v/v纯化水余量余量余量反应程序如下：95℃10min——1个循环95℃30s；58℃30s——40个循环检测ct值结果如下表：(ct-fam/ct-vic)结论：本发明各浓度质粒的检出率为100％，相比于对比例，本发明的ct值更低，特异性更好。sequencelisting<110>广州海思医疗科技有限公司<120>一种同时检测nudt15和ugt1a1基因多位点突变的试剂盒<130><160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列<400>1aacattaacttggtgtatcgattggt26<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2agcaggcccaggacaagt18<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列<400>3tgccatatatatatatataagtaggaa27<210>4<211>29<212>dna<213>人工序列<400>4tgccatatatatatatatataagtaggaa29<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列<400>5cagtcaaacattaacttggtgtatcg26<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6ctttgctcctgccagaggttcg22<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7tagcacctgacgcctcgttg20<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<400>8tctttcacatcctccctttggg22<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列<400>9ccaccagatggttcagatcttg22<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10tgggttccttgggaagaactac22<210>11<211>13<212>dna<213>人工序列<400>11caacgcagtccct13<210>12<211>14<212>dna<213>人工序列<400>12caacacagtcccct14当前第1页12