一种用于检测大豆过敏原GlymBd28K基因的LAMP引物组合物及其试剂盒的制作方法

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种用于检测大豆过敏原glymbd28k基因的lamp引物组合物、检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

食物过敏是机体免疫系统对某些食物产生的异常免疫反应，相应的免疫球蛋白会和这些食物结合，释放出很多化学物质，引起过敏症状(如恶心、呕吐、湿疹等)，严重者会导致过敏性休克发生。世界粮农组织1995年报告，90％以上的食物过敏是由花生、大豆、牛奶、鸡蛋、鱼、贝类产品、坚果类等引起。大豆蛋白在食品加工业的广泛应用，给大豆敏感人群带来了诸多食品安全问题，多数食物致敏原引起人的ⅰ型过敏反应，在大豆消化过程或吸入大豆粉末后会起不良反应，主要表现为过敏性皮炎或胃部不适，主要症状是口周红斑、唇肿、口腔疼痛、舌咽肿、恶心和呕吐等，但一般不会有生命危险。因此对于商品是否含有大豆过敏原的抽检，找到一种快速、简单的检测方法显得尤为重要。

大豆(glycinemax)在我国产量丰富、食用广泛，长久以来一直被广泛应用于食品和饲料的加工原料。但随着食用量的增加，引起过敏发病的几率不断上升。大豆过敏原包括种子储藏蛋白、结构蛋白和防御相关蛋白，其中种子储藏蛋白中的7s球蛋白组分中的glymbd28k，glymbd30k及β-伴球蛋白glymbd60k是3种主要的过敏原。近年来，检测大豆过敏原在过敏反应中的作用显得尤为重要。在此，选取大豆蛋白glymbd28k过敏原基因为检测对象以检测大豆过敏原成分。

不言而喻，对检测食品中是否含有大豆过敏原具有十分重要的意义。目前，检测大豆过敏原主要有以下两种检测方法：

1)检测大豆过敏原蛋白成分，如酶联免疫吸附法(elisa)、质谱法(maldi—tof/ms)、westernblotting检测等方法。

2)检测过敏原基因残留，如pcr检测技术，焦磷酸测序技术等，其中pcr检测方法是最主要、最准确的方法，但这类方法操作过程比较复杂，需要专业人员；所使用的仪器比较昂贵，检测也很耗时。另外电泳常用的eb染料为强致癌物质，有较强毒性，且难以实行现场检测。

综上所述，找到一种快速、简单、安全的检测大豆过敏原的检测方法显得极为必要。

环介导等温基因扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，以下简称lamp法)是由notomi等建立的一种快速高效、特异性强的核酸等温扩增技术，其具有快速简单、操作方便、灵敏度高、容易普及、安全可靠等优点，目前该技术尚未使用于检测大豆过敏原。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于检测大豆过敏原glymbd28k基因的lamp引物组合物，并提供一种含有上述lamp引物组合物的检测试剂盒及使用该lamp引物组合物的检测方法，本发明所述的检测方法具有特异性强、响应速度快、灵敏度高、结果判定简单、操作简便、价格低廉、应用范围广等特点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种用于检测大豆过敏原glymbd28k基因的lamp引物组合物，其包括两条外引物(f3、b3)和两条内引(fip、bip)，这4条引物的核苷酸序列如下所示：

正向外引物f3(seqidno：1)：ggaagcaaagctgggatt；

反向外引物b3(seqidno：2)：gaaatatgtgaacttatgatggatg；

正向内引物fip(seqidno：3)：

tgaaccagatggaatcatgtacaatgatgatgaactagcggaa；

反向内引物bip(seqidno：4)：

taggagaaggtcagagacttcacgatgcatgtacctggaagg。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述lamp引物组合物的用于检测大豆过敏原glymbd28k基因的试剂盒。

为了进一步优化上述试剂盒，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地，该试剂盒还包括lamp工作液、荧光指示剂和bstdna聚合酶。

优选地，所述lamp工作液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4和tween-20。

优选地，所述荧光指示剂选自sybrgreen、evergreen、picogreen、syto系列中的至少一种；更优选为sybrgreen，更具体的说为sybrgreenⅰ。

优选地，该试剂盒还包括显色剂。

优选地，所述显色剂选自hnb、calcein、甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞和百里酚蓝；更优选为中性红(neured染料)。

优选地，该试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有含有大豆过敏原glymbd28k基因的样品稀释液，所述阴性对照为不含大豆过敏原基因的去离子水。

优选地，该试剂盒的检测限为0.4ng/μl。

在本发明一实施例中，一种用于检测大豆过敏原glymbd28k基因的试剂盒包含以下组分：

1)lamp工作液：20mmtris-hcl(ph8.8，25℃)，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，8mmmgso4，0.1％tween-20；

2)荧光指示剂：sybrgreenⅰ；

3)引物液：seqidno：1～seqidno：4所示的引物，4条引物浓度都为100μm；

4)bstdna聚合酶：浓度为8u/μl；

5)显色剂：neured染料(500um)；

5)对照：阳性对照为含有大豆过敏原glymbd28k基因的样品稀释液，阴性对照为不含大豆过敏原基因的去离子水。

本发明的第三个目的是提供一种非诊断和治疗目的的用于检测大豆过敏原glymbd28k基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1)采用ctab法提取纯化待测样品的dna；

步骤2)用上述lamp引物组合物进行环介导等温扩增反应；

步骤3)结果判断：根据是否出现“s”型扩增曲线判断扩增结果，和/或根据反应体系是否出现颜色变化判断扩增结果。

优选地，所述步骤2)的具体操作过程如下：在pcr八联管中配制反应混合体系：lamp工作液16.7μl，引物液1.3μl，bstdna酶1μl，显色剂1μl，样品dna5μl，用含有大豆过敏原glymbd28k基因替代待检dna设置阳性对照，用不含大豆过敏原基因的去离子水替代待检dna作为阴性对照。将配制好的体系均匀并离心，使pcr八联管中没有气泡为止，于60～65℃反应45～90min，同时采集荧光信号，并在95℃保持5min，最后降到室温25℃即可；更优选地，所述环介导等温扩增反应的反应条件为63℃60min。

优选地，上述步骤2)可采用荧光指示剂sybrgreenⅰ替换显色剂neured染料，也可同时加入荧光指示剂sybrgreenⅰ和显色剂neured染料。

可理解的是，在满足恒温扩增反应的条件下，上述反应混合体系中各试剂的浓度及用量均可进行适当的调整，但采用上述体积及浓度的试剂，其扩增效果最佳，检测结果更为准确。

本发明基于环介导等温扩增技术(lamp法)，根据靶基因设计的四条引物能特异性识别靶基因序列上的六个特异的区域，启动循环链置换反应，在靶标dna区启动互补链合成，结果生成含有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。采用4条特异性引物及一种具有链置换活性的dna聚合酶(bstdna聚合酶)，在60～65℃对核酸进行扩增反应，反应需在恒温条件下进行(如63℃)，反应时间一般为60min左右，在45～90min的短时间内扩增效率可以达到10⁹～10¹⁰个拷贝。加入模板dna，在63℃反应60min后，在95℃保温5min，终止反应，降温至室温25℃。该反应会产生大量白色沉淀，是由于在反应发生有核酸大量合成时，从dntp析出的焦磷酸根离子与反应溶液中mg²⁺离子结合，生成了白色的焦磷酸镁沉淀。

与pcr技术或其他技术相比，本发明具有特异性强、响应速度快、灵敏度高、结果判定简单、操作简便、价格低廉、应用范围广等特点，具体地来说，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)特异性强：设计的4条引物对靶序列6个区域的识别保证了lamp扩增反应的高特异性，可以从相差一个核苷酸的基因样品中找出相应的靶序列进行等温扩增。

2)响应速度快：lamp技术能在60min内完成高效率的基因扩增。

3)灵敏度高：lamp扩增的灵敏度是普通pcr扩增的10～100倍，所需模板数为10copies或者更少。

4)结果判定简单：可根据荧光检测仪上的荧光曲线判定结果，或者加入显色剂，即可通过裸眼观察反应液的颜色变化来判定扩增结果，不需要经过凝胶电泳检测。

5)操作简便，价格低廉：只需将反应液配制好，在63℃恒温水浴锅中加热60min左右即可判断扩增与否。

6)应用范围广：lamp扩增技术不仅可以用来检测dna、rna，还可以通过联合其他技术，如纳米技术、核酸适配体技术，检测microrna、蛋白质以及金属离子等。

附图说明

图1是本发明一实施例中的大豆特异性荧光检测结果图；

图2是本发明一实施例中的不同产地大豆荧光检测结果图；

图3是本发明一实施例中的大豆灵敏度荧光检测结果图(dna浓度分别为10，1，1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，单位ng/μl)；

图4是本发明一实施例中的大豆特异性比色检测结果图(1～8分别表示大豆、开心果、杏仁、榛子、芝麻、花生、核桃、芥末)；

图5是本发明一实施例中的大豆灵敏度比色检测结果图(1～6分别表示大豆样品浓度梯度：1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0，单位ng/μl)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例一

本实施例为大豆过敏原荧光检测方法：

一、大豆过敏原glymbd28k基因的lamp检测试剂盒，其包括lamp工作液、引物液、bstdna聚合酶、对照，具体如下：

1)lamp工作液：20mmtris-hcl(ph8.8，25℃)，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，8mmmgso4，0.1％tween-20；

2)荧光指示剂：sybrgreenⅰ；

3)引物液：含有lamp引物组合物，4条引物浓度都为100μm；4条引物为：

正向外引物f3：ggaagcaaagctgggatt(seqidno：1)；

反向外引物b3：gaaatatgtgaacttatgatggatg(seqidno：2)；

正向内引物fip：

tgaaccagatggaatcatgtacaatgatgatgaactagcggaa

(seqidno：3)；

反向内引物bip：

taggagaaggtcagagacttcacgatgcatgtacctggaagg

(seqidno：4)；

4)bstdna聚合酶：浓度为8u/μl；

5)对照：阳性对照为含有大豆过敏原glymbd28k基因的样品稀释液，阴性对照为不含大豆过敏原基因的去离子水。

二、利用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：

1)采用ctab法提取纯化待测样品的dna；

a)取150mg大豆或其他样品放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎，液氮反复加入3～4次，磨碎成粉末为止；

b)将上述粉末置于1.5ml离心管中，加入600ulctab，15ul蛋白酶k，在65℃条件下温育30min；

c)加入500ultris饱和酚：氯仿：异戊醇(体积比25：24：1)混合液，强烈振荡，12000r/min离心15min；

d)加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比24：1)，上下颠倒混匀；12000r/min常温离心15min；

e)吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后12000r/min离心10min，弃上清液；

f)将沉淀用70％乙醇反复洗涤2～3次，吸弃；

g)用60ulte缓冲液溶解dna沉淀(te量视dna沉淀多少而定)；

h)用dna/rna蛋白分析仪检测其纯度。

2)等温扩增检测：在pcr八联管中配制反应混合体系：lamp工作液17.7μl(包含荧光指示剂sybrgreeni1μl)，引物液1.3μl，bstdna酶1μl，样品dna5μl，用含有大豆过敏原glymbd28k基因替代待检dna设置阳性对照，用不含大豆过敏原基因的去离子水替代待检dna作为阴性对照。将配制好的体系均匀并离心，使pcr八联管中没有气泡为止，于60～65℃反应60min，同时采集荧光信号，并在95℃保持5min，最后降到室温25℃即可。

3)结果判断：根据是否出现“s”型扩增曲线判断扩增结果。

如图1所示，本实施例中大豆特异性荧光检测，阳性样品出现“s”型扩增曲线，即为大豆(图1中黑色曲线)，其他阴性对照没有扩增曲线，分别为开心果、杏仁、榛子、芝麻、花生、核桃、水。

实施例二

本实施例采用实施一的检测方法对不同产地大豆进行荧光检测，其检测结果如图2所示。

通过对不同产地大豆样品(购买自临沂、佳木斯、南京、杭州)进行实验，发现4个不同产地的大豆样品均有扩增信号(图2)，其他阴性对照没有扩增信号(阴性对照为花生、开心果、杏仁、榛子、芝麻、核桃、芥末、水)。

实施例三

本实施例采用实施一的检测方法对不同浓度的dna样本进行检测，以对大豆灵敏度进行分析，dna浓度分别为10，1，1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，单位ng/μl，其荧光检测结果图如图3所示。

根据图3所示的大豆灵敏度荧光检测结果，发现10ng/μl和1ng/μl有扩增信号(图3)，而其他浓度没有扩增信号，可进一步探索1ng/μl至0.1ng/μl区间的扩增信号，以进一步确定检测灵敏度。

实施例四

本实施例中试剂盒采用显色剂neured染料替代实施例一中的荧光指示剂sybrgreenⅰ，其余均与实施例一相同。

本实施例中大豆过敏原glymbd28k基因特异性比色检测，其结果如图4所示，阳性样品出现粉红色(图4中1所示)，其他样品均是淡棕色，为阴性样品(图4中2～8所示，分别为开心果、杏仁、榛子、芝麻、花生、核桃、芥末)。

本实施例还进行大豆过敏原arah6基因灵敏度比色检测，其结果如图5所示，出现粉红色的样品浓度依次为1.0、0.8、0.6、0.4ng/μl(即图5中1～4)，其他淡棕色样品浓度为0.2、0ng/μl(即图5中5～6)，也即检测限为0.4ng/μl。

虽然实施例一和实施例四为分别单独采用荧光指示剂或显色剂，但可理解的是，也可在同一反应体系中同时加入荧光指示剂和显色剂。

由上述实施例可知，本发明所述的检测方法具有快捷迅速、操作简单、特异性强、灵敏度高等优点，适用于实时现场检测。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

sequencelisting

<110>上海速创诊断产品有限公司；复旦大学；上海大学

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