本发明属于分子生物学技术领域，涉及与与二花脸猪产仔数相关的猪12号染色体snp标记及检测方法。
背景技术：
产仔数是猪最重要的生产性状之一，是猪的商业化品系选育中的重要选育指标，直接关系到养猪产业的经济效益。作为复杂的数量性状，产仔数遗传力较低，且影响因素很多。从排卵前到分娩后，母猪的品种、年龄、胎次、与配公猪的精液品质以及妊娠过程中母猪的营养状况等多种因素，都会对母猪的产仔数造成不同程度的影响。然而传统的选育方法提高猪产仔数的进展缓慢，已经不能满足生产所需。分子标记辅助选择(molecularmarker-assistedselection,mas)技术的问世和应用，加速了产仔数选育提升的速度，使得许多基因标记被鉴别并投入生产。随着商业需求的扩大，现有的分子标记已经不能满足生产所需，因此鉴别和利用新的基因标记来提高猪的产仔性能具有重要价值。
二花脸猪是素以高繁殖性能著称的太湖流域地方猪种的一种，其创造的最高产仔42头的记录至今未被打破。二花脸猪经产母猪窝产仔数平均约为16头左右，窝产活仔14头以上，而且性成熟早，卵巢发育快。二花脸母猪第一次发情最早可在50日龄之前，8月龄后备母猪平均每情期排卵数能达到26个。多年以来虽然国内已有大量的研究机构在努力鉴别二花脸猪种高繁殖力的遗传机理，但随着研究方法、手段、材料及群体本身的变化，不断有新的二花脸猪种高繁殖力遗传机制被揭示，但被有效利用的较少。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术不足，产仔数的低遗传力，提供与母猪窝总产仔数和窝产活子数相关的snp标记。
本发明的第2个目的在于提供用于检测上述snp标记的引物和检测方法。
本发明的第3个目的在于提供上述snp标记的用途。
与二花脸猪产仔数相关的snp标记，所述snp标记位于猪12号染色体上的成对核糖体蛋白激酶rps6kb1基因的核苷酸序列上，所述snp标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪12号染色体上g.37433196核苷酸位点，且具有为g/c多态性，所述snp标记与二花脸母猪窝产总仔数显著相关，与窝产活子数极显著相关。g.37433196位点具有gc基因型的二花脸母猪窝总产仔数显著高于具有gg基因型的二花脸母猪；g.37433196位点，具有gc基因型的二花脸母猪窝总活仔数极显著高于具有gg基因型的二花脸母猪。
一种基于本发明所述的snp开发分子标记的方法，以含有本发明所述的snp标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以二花脸母猪基因组dna为模板进行pcr扩增，使本发明所述的snp标记转化为分子标记。
其中，所述的引物对序列为上游引物：seqidno：2，下游引物：seqidno：3；所述的分子标记序列如seqidno：1所示，所述的snp位点位于第119位，存在g/c多态性。
按照本发明上述方法得到的分子标记。
所述的分子标记优选序列如seqidno：1所示，所述的snp位点位于第119位，存在g/c多态性。
一种用于检测所述的snp标记的引物对，上游引物为：seqidno：2，下游引物为：seqidno：3。
一种检测本发明所述的snp标记的方法，包含pcr扩增二花脸母猪基因组中含有本发明所述的snp标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的g/c多态性。
所述的检测本发明所述的snp标记的方法，优选包括以下步骤：
(1)取二花脸母猪的耳组织样品并提取总dna；
(2)用已提取的二花脸母猪基因组dna为模板，使用所述的引物对进行pcr扩增；
(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在seqidno：1第119位的g/c多态性。
其中，步骤(2)所述的pcr优选扩增反应体系为：dna模板2.5μl、seqidno：2和seqidno：3所示的引物各1.25μl、pcrmix试剂25μl、双蒸水20μl；其中所述dna模板浓度为30ng/μl，所述引物的浓度为10mol/l，所述pcrmix试剂为南京欧科生物技术有限公司的p394961l型号试剂；pcr扩增的反应程序为：预变性96℃2min；变性96℃20s；退火60℃30s，延伸72℃60s，35个循环；延伸72℃10min。
本发明所述的snp标记、所述的分子标记、所述的引物对在筛选高产二花脸母猪品系中的应用。
与二花脸猪产仔数相关的猪12号染色体g.37433196位点snp标记及检测方法，包括检测二花脸母猪与二花脸猪产仔数相关的snp标记的基因型，选留g.37433196核苷酸位点的gg型个体和cc型个体作种猪，生产f1代母猪为高产母猪。
本发明中所述的产仔数包括窝总产仔数和窝总活仔数。
有益效果：
本发明提供的snp标记与二花脸母猪的产仔性能相关，因此，可以通过鉴定该snp标记来筛选高产的二花脸母猪品系，所得的二花脸母猪高产品系具有重要的经济效益与社会价值。
附图说明
图1rps6kb1基因的g.37433196位点的基因型判定
注：1.g.37433196位点gg型；2.g.37433196位点cc型；3.g.37433196位点gc型
具体实施方式
以下实施案例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
1、实验动物来源
二花脸母猪来自常州市焦溪二花脸猪专业合作社三个基地143头纯种二花脸母猪；苏州苏太企业71头纯种二花脸母猪；江苏省常熟市二花脸猪保种场90头纯种二花脸母猪，总数304头。
2、提取基因组dna
采集304头母猪的耳组织样品，放置于装有70％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。
使用传统酚/氯仿法提取耳组织基因组dna，所需试剂包括：
裂解液实验室配备
蛋白酶k(德国merck生物科技有限公司)
tris饱和酚(北京索莱宝生物科技有限公司)
tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)(北京索莱宝生物科技有限公司)
氯仿(江苏永华精细化学品有限公司)
无水乙醇(广东光华科技股份有限公司)
3m乙酸钠(北京索莱宝生物科技有限公司)
具体步骤如下所述：
(1)取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入2ml离心管中；
(2)加入裂解液(自己配备)800μl，及蛋白酶k30μl(0mg/ml)；
(3)样品置于55℃恒温箱中孵育过夜，至管中无组织块为止；
(4)加入tris饱和酚800μl，轻微混匀10min，4℃12000r/min离心12min；
(5)取650μl上清加tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)800μl，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；
(6)取550μl上清，加氯仿800μl，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；以下步骤换1.5ml的离心管
(7)取450μl上清，加无水乙醇800μl，3m乙酸钠40μl，混摇6min，4℃1000r/min离心8min；
(8)弃上清留下dna沉淀团，加入1000μl70％乙醇(自己配备)，混摇5min，4℃1000r/min离心5min，弃上清(如需要可重复一次)；
(9)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；
(10)样品加100μl超纯水，轻微吹打至dna溶解，经过nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μl于-20℃下保存备用。
3、与产仔数关联位点的筛选与检测
对10头(5头极端高产，5头极端低产)妊娠12天二花脸母猪进行重测序，平均测序深度为16.625x，共发现了19834951个snp。根据这一结果，发现rps6kb1基因在-2000bp-0bp的启动子区范围内有9个snp位点，在外显子区没有snp位点，在3’非翻译区(untranslatedregions,utr)有8个snp位点。对鉴别的snp，根据以下原则选择进行下一步分型：用plink软件计算各个snp位点间的ld值，剔除最小等位基因频率＜0.2的snp位点，ld值≥0.6视为连锁。对筛选后的snp位点以304头的二花脸群体分型验证。扩增序列的引物信息如表1所示。
表1rps6kb1基因候选snp位点引物序列信息
将扩增产物进行测序，测序结果用dnaman软件与genbank中猪的相关基因片段序列比对、分析，判读各位点的基因型，然后利用sas软件进行基因型对表型的影响效应分析。
分析模型为yijklmno＝μ+hfsi+agej+pak+pl+am+gn+bo+eijklmno
其中：yijklmno为每头母猪每胎次产仔数；μ为均值；hfsi为每头母猪所在群体、产仔年份、产仔季节的组合，agej是每头母猪的日龄，pak为胎次，gn为基因型，均为固定效应，包含胎次作为协变量；pl为永久环境随机效应；am为基因的随机加性效应；bo为与配公猪的随机效应；eijklmno为随机的剩余效应。
结果以平均数±标准误的形式呈现，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。
各位点与产仔数的关联分析结果如表2所示。
表2rps6kb1基因snp位点基因型与产仔数关联分析结果
由表2可知，g.37384779、g.37386712、g.37431651各个位点在全部胎次和经产胎次中与总产仔数和产活仔数均无关联。g.37433196位点在全部胎次的分析结果中显示与总产仔数显著相关，gc型显著高于gg型(p<0.05)；与产活仔数极显著相关，gc型极显著高于gg型(p<0.01)；在经产胎次的分析中，与全部胎次的分析结果相同。g.37433718位点在全部胎次的分析中与产仔数没有显著关联，但在对经产胎次的分析中，与总产仔数显著相关，ga型高于gg型(p<0.05)，与产活仔数极显著相关，ga型极显著高于gg型(p<0.01)。
因g.37433196和g.37433718位点高度连锁，故而取g.37433196位点为代表。
4、目的片段pcr扩增与测序
用已提取的dna为模板，根据所设计的引物，进行pcr扩增：取dna模板2.5μl、上游引物和下游引物各1.25μl、pcrmix试剂25μl、双蒸水20μl；设置pcr扩增体系：预变性96℃2min；变形96℃20s；退火60℃30s；延伸72℃60s；35个循环；然后延伸10min。
对rps6kb1基因g.37433196位点以304头的二花脸群体分型验证，扩增序列的引物信息如表3所示。
表3rps6kb1基因g.37433196位点引物序列信息
将扩增产物进行测序，测序结果用dnaman软件与genbank中猪的相关基因片段序列比对、分析，判读各位点的基因型，然后利用sas软件进行基因型对表型的影响效应分析。
分析模型为yijklmno＝μ+hfsi+agej+pak+pl+am+gn+bo+eijklmno
其中：yijklmno为每头母猪每胎次产仔数；μ为均值；hfsi为每头母猪所在群体、产仔年份、产仔季节的组合，agej是每头母猪的日龄，pak为胎次，gn为基因型，均为固定效应，包含胎次作为协变量；pl为永久环境随机效应；am为基因的随机加性效应；bo为与配公猪的随机效应；eijklmno为随机的剩余效应。
结果以平均数±标准误的形式呈现，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。
表4给出了rps6kb1基因g.37433196位点在纯种二花脸群体中对产仔数的影响效应。由表2可知，纯种二花脸猪中，g.37433196位点的gc基因型个体与gg型个体相比较：窝总产仔数平均增加约0.6头，窝总活仔数平均增加约0.7头。由此可见，在二花脸猪种中，继代选育g.37433196位点的gg型个体和cc型个体，通过杂交得到f1代gc型母猪为高产母猪，具有很高的经济价值。
表4rps6kb1基因g.37433196位点基因型与产仔数关联分析结果
注：产仔数以平均数±标准误展示，个体数及产仔数单位为头。
<110>南京农业大学
<120>与二花脸猪产仔数相关的猪12号染色体snp标记及检测方法
<160>3
<210>1
<211>780
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>g/c
<220>
<223>含g.37433196核苷酸位点的分子标记
<400>1
tgccagcaatagtgacaaacactgtaacttttctgcataaaaagcattaattgtacacct60
accatccacacaaatacagtttttcaaacttaacatgaggtaaaattaatttcctatagt120
gtggcgagtttattgagaaattgtgtttcataaatggatttccctactatgactgtgaaa180
acatatcaagtgccactttagtgtcacagacagaaagcacacacctatgcaatatggctt240
accctatatttatttgtaaaaacccaagcatagtttaaaagtatatgtcaataatattag300
tcttgagtttcttagagagttgtttatgatttctccaggtaagtgtataaaagagattgt360
ttttctttcatcacttgattattttctttaaaatcagctattacaggatatttttttatt420
ttatacatgctgtttttttaattaaaatataatcactgagaactgaagtttactaatttt480
gattttatacagtttgtagcgtacagaataaactgggatttataaaccagctgtgattaa540
caatgtaaagtattaattattgaacttgaaccagatttttaggaaaattgttatttcttt600
ttcccctttatgatcttaactaatttgaatcctttaagacggatttttccatactatttt660
ttgagatagtagataactggggggaagaatgcatgtatgatactccataaattcaacgtt720
ctttaagaaataaattacaaacaagctccatcttcagtagtattaatacaccaagccttg780
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>上游引物
<400>2
tgccagcaatagtgacaaacac22
<210>3
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物
<400>3
aacaagctccatcttcagtagt22