本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及安吉小鲵微卫星标记及其应用。
背景技术：
微卫星DNA，又称为短串联重复序列或简单序列重复。它是以1-6个碱基的短核苷酸为基本单位首尾相连组成串联重复序列，由于重复次数不同以及重复程度的不完全造成了每个位点的长度多态性。由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，再经电泳分析，即可显示不同基因型个体微卫星的多态性。微卫星由于分布广泛，密度大，多态性丰富，遵循孟德尔分离定律，共显性遗传、易于PCR扩增，所需DNA含量极少，对DNA质量要求不高，结果重复性好等优点，目前已被广泛应用于遗传多样性、亲缘关系分析、连锁图谱构建、功能基因定位、分子标记辅助育种等领域。
安吉小鲵(Hynobius amjiensis)隶属于两栖纲(Amphibia)，有尾目(Urodela)，小鲵科(Hynobiidae)，小鲵属(Hynobius)，是于1991年才发表的物种。安吉小鲵为我国的特有物种，仅在浙江省安吉县龙王山、浙江省清凉峰、浙江省天目山口和安徽清凉峰内有所分布。两栖动物对生境质量要求较高，随着生态环境质量下降和保护区内游客的干扰，安吉小鲵的适宜生境在不断地缩减，种群的长期稳定和持续发展受到严重威胁。目前，安吉小鲵已被列入《中国物种红色名录》、《中国濒危动物红皮书》、《IUCN濒危物种红皮书》和《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》。同时，安吉小鲵被列为全球十大濒危的两栖动物，种群的长期生存发展面临巨大的挑战。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种安吉小鲵微卫星标记及其应用。本发明的安吉小鲵微卫星位点及其特异性扩增引物，为安吉小鲵的种群遗传学、亲缘关系分析、人工辅助繁育及后期保护提供有效的工具。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种安吉小鲵微卫星标记，安吉小鲵微卫星标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9；或为上述任一核苷酸序列的互补序列；
所述SEQ ID NO：2对应微卫星位点Hyam26；
所述SEQ ID NO：7对应微卫星位点Hyam74；
所述SEQ ID NO：8对应微卫星位点Hyam87；
所述SEQ ID NO：9对应微卫星位点Hyam91。
作为本发明的安吉小鲵微卫星标记的改进：安吉小鲵微卫星标记的特异性引物对为如下任一所示：
微卫星位点Hyam26特异性引物：Primers:L:TGATCCCAATCAATCCATGA
R:AAGGTTGGAGACCGATGATG
微卫星位点Hyam74特异性引物：Primers:L:GCTCTCCTCCAGACTCCCTT
R:TTTTCCTTGAATCAGGCAGG
微卫星位点Hyam87特异性引物：Primers:L:TGTGACAGCTTAGCGACTGC
R:CTTGTTCCGAGAAGGAGACG
微卫星位点Hyam91特异性引物：Primers:L:TCAATACCAGCATGCCTCAA
R:GCAGCAGTGACAGCAAAAAG。
本发明还同时提供了上述安吉小鲵微卫星标记的用途：用于分析安吉小鲵种群遗传多样性、分析安吉小鲵亲缘关系、分析安吉小鲵人工辅助繁育、用于对安吉小鲵后期保护。
作为本发明的安吉小鲵微卫星标记的用途的改进：利用引物对检测安吉小鲵种群遗传多样性的方法包括如下步骤：
1)、提取(可采用酚-氯仿法提取)安吉小鲵的基因组DNA；
2)、微卫星PCR扩增：
采用微卫星位点Hyam26、Hyam74、Hyam87、Hyam91中任一的特异性引物，以安吉小鲵基因组DNA为模板进行PCR扩增，从而获得安吉小鲵个体微卫星扩增产物；
3)、扩增产物多态性检测：将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和DNA测序；
4)、遗传多样性分析：根据每个安吉小鲵个体的微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用CERVUS 3.0和POPGENE 3.2计算遗传多样性参数。
本发明还同时提供了上述安吉小鲵微卫星标记的特异性引物对的获得方法：引物对设计参数为：引物长度均为20bp，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度55-65℃，GC含量40％-60％之间。
作为本发明的安吉小鲵微卫星标记的特异性引物对的获得方法的改进：
(1)安吉小鲵简化基因组测序：提取安吉小鲵的DNA，经酶切，建立测序文库，采用Illumina HiSeqTM4000进行简化基因组测序，获得安吉小鲵原始序列；
(2)安吉小鲵微卫星位点的检测：将简化基因组测序获得的原始序列用软件MISA进行微卫星位点查找，得到多个微卫星位点；
(3)对筛选得到的微卫星位点用Primer3软件进行批量引物设计，引物设计要求为如上所述的引物对设计参数，从设计成功的引物中随机选取一部分进行多态性验证。
本发明的整体发明内容如下：
本发明提供9个微卫星位点，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-9所示，或为上述核苷酸序列的互补序列。
本发明还提供分别用于扩增上述9个微卫星位点的引物对。优选地，所述引物对设计参数为：引物长度均为20bp，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度55-65℃，GC含量在40％-60％之间。优选地，上下游序列分别为SEQ ID：10(Hyam06-L)、SEQ ID：11(Hyam06-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQ ID：1所示的微卫星标记(Hyam06)；上下游序列分别为SEQ ID：12(Hyam26-L)、SEQ ID：13(Hyam26-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQ ID：2(Hyam26)所示的微卫星标记；上下游序列分别为SEQ ID：14(Hyam35-L)、SEQ ID：15(Hyam35-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQ ID：3(Hyam35)所示的微卫星标记；上下游序列分别为SEQ ID：16(Hyam39-L)、SEQ ID：17(Hyam39-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQ ID：4(Hyam39)所示的微卫星标记；上下游序列分别为SEQ ID：18(Hyam40-L)、SEQ ID：19(Hyam40-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQ ID：5(Hyam40)所示的微卫星标记；上下游序列分别为SEQ ID：20(Hyam63-L)、SEQ ID：21(Hyam63-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQ ID：6(Hyam63)所示的微卫星标记；上下游序列分别为SEQ ID：22(Hyam74-L)、SEQ ID：23(Hyam74-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQ ID：7(Hyam74)所示的微卫星标记；上下游序列分别为SEQ ID：24(Hyam87-L)、SEQ ID：25(Hyam87-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQ ID：8(Hyam87)所示的微卫星标记；上下游序列分别为SEQ ID：26(Hyam91-L)、SEQ ID：27(Hyam91-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQ ID：9(Hyam91)所示的微卫星标记。
综上所述，本发明从安吉小鲵基因组DNA中筛选出9个微卫星位点(精选其中的4个)，根据微卫星重复序列两端的侧翼区设计特异性引物并进行扩增，获得的扩增产物具有高度的多态性，可用于安吉小鲵的群体遗传学、亲缘关系分析、人工辅助繁育和后期保护等领域。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、
1、安吉小鲵简化基因组测序
提取安吉小鲵的DNA，经酶切，建立测序文库，采用Illumina HiSeqTM4000进行简化基因组测序，获得安吉小鲵原始序列；
2、含有微卫星重复单元的序列的查找
从获得的安吉小鲵的原始序列中用MISA软件进行微卫星重复单元序列的查找；参数设置为查找含有一个碱基重复10次及10次以上，二个碱基重复次数6次及6次以上，三个碱基重复5次及5次以上，四个碱基重复5次及5次以上，五个碱基重复5次及5次以上，六个碱基重复5次及5次以上。同时，当两个微卫星之间的距离小于100bp的时候，两个微卫星组成一个复合微卫星。共筛选出15539个含有微卫星重复单元的序列，并从中设计引物进行多态性的检测。
3、微卫星引物的设计
从含有微卫星重复单元的基因序列中，选取符合引物设计的序列使用Primer 3进行批量引物设计。主要参数设置为：引物长度20bp，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度55-65℃，GC含量40％-60％之间，尽量避免二级结构的出现。
4、对设计的引物的扩增产物进行多态性检测：
(1)基因组DNA的提取：
采用酚-氯仿法提取24个安吉小鲵肌肉组织的基因组DNA；
(2)微卫星PCR扩增：
用上述设计的引物扩增安吉小鲵基因组DNA；反应体系10μL：模板DNA 0.4μL(10ng/μL)，正反向引物各0.2μL，TaKaRa Taq酶0.08μL，10×PCR Buffer(Mg2+free)1.0μL，Mgcl2 0.8μL，dNTP Mixture 0.8μL，无菌水6.52μL。
PCR反应在S1000TMThermal Cycler仪中进行，扩增程序如下：94℃预变形45min；94℃变性30s，退火温度下复性30s，72℃延伸30s，35个循环；最终72℃延伸3min。
(3)扩增产物多态性检测：
将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和DNA测序以确定安吉小鲵微卫星标记在不同个体上的等位基因大小。
(4)遗传多样性分析：
根据每个微卫星扩增产物的等位基因大小确定基因型，采用CERVUS 3.0和POPGENE 3.2计算遗传多样性参数，从而筛选出具有多态性的微卫星引物及对应的微卫星标记。
经过多样性检测，本发明筛选了9个具有遗传多态性的微卫星位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-9所示，其所对应的扩增引物的信息如表1所示。
表1、安吉小鲵微卫星位点及其对应的引物
如表2所示，在24个样本中对上述9个微卫星位点进行遗传多样性分析的结果表明：9个微卫星位点的等位基因数分别为2-4个，平均等位基因数目为3.33个，观测杂合度在0.000-1.000，期望杂合度在0.308-0.691，PIC(Polymorphic information content，多态性信息含量)值在0.279-618。从而证明本发明筛选的微卫星位点的引物具有遗传多态性。
表2、9个微卫星位点的遗传特征(Ta：退火温度；NA：等位基因数目；HO：观测杂合度；HE：期望杂合度；PIC：polymorphic information content，多态信息含量；P-HWE：Hardy-Weinberg equilibrium，哈迪温伯格平衡检验)
注：表中的*表示显著偏离哈迪-温伯格平衡。
本发明的微卫星位点及其扩增引物还可用于安吉小鲵遗传多样性、亲缘关系分析、人工辅助育种和后期保护等领域的研究。
实验一、
将安吉小鲵和义乌小鲵，分别按照上述实施例1所述内容进行检测，所得结果为：
安吉小鲵能扩增得到微卫星位点Hyam26、微卫星位点Hyam74、微卫星位点Hyam87、微卫星位点Hyam91相应的序列；而义乌小鲵不能获得上述4个微卫星位点相应的序列。
就微卫星位点Hyam06、微卫星位点Hyam35、微卫星位点Hyam39、微卫星位点Hyam40、微卫星位点Hyam63而言，安吉小鲵和义乌小鲵均能扩增得到相应的序列。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110> 浙江师范大学
<120> 安吉小鲵微卫星标记及其应用
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<211> 248
<212> DNA
<213> 安吉小鲵Hynobius amjiensis 微卫星分子标记Hyam06
<400> 1
ccgaactgtc gggtaaagat gtgtgtaatt caaatagcag atagatagat 50
agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat aggtagataa 100
atagcactca tatgccattt ggcacaaact tctgggcata gctgataatg 150
gggattgctc catgctagta cttatagagc tctccgcggt ctttgatatg 200
gttgcccatg aaatcttggt cacccgtttc actgcagaac taggggct 248
<210> 2
<211> 330
<212> DNA
<213> 安吉小鲵Hynobius amjiensis 微卫星分子标记Hyam26
<400> 2
tgatcccaat caatccatga ggcaaactat ggacacttca agttgaacca 50
cgtggcaaag aaggtctatg gatggctggt caaagactct gaatatggac 100
tgatctagtg agggtttcaa cctcaactga tgtgacctgc tgctgatctt 150
ggtgggggag gcagcaggtc atggcagggg ctcaggcacg tgctacttcc 200
cagaggagga agaacgctgc gcacctgctg gccctctaga gagcagtttg 250
agcctgtagt agtagtagta gtagtagcag cagcagcagc agcagcagca 300
gcagcatcac catcatcggt ctccaacctt 330
<210> 3
<211> 265
<212> DNA
<213>安吉小鲵Hynobius amjiensis 微卫星分子标记Hyam35
<400> 3
taaagtgaga cgtgggggtc gttctttctc ccatcagggg gccctcctct 50
ggaacacgtt cccagaagag cttaaagagg ccaactcctt agctagcttc 100
tgtcgccatc tgtagacttg gcttcgccag ggacaaagat tgacgcgttg 150
agaccccatc ggggtaattt gaaccgcgcg ttactagacg cacctcatca 200
tcatcatcat catcatcatc atcatcatca ggacctgtca ctgaaaacct 250
gtgtccgcct ctaga 265
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<211> 304
<212> DNA
<213>安吉小鲵Hynobius amjiensis 微卫星分子标记Hyam39
<400> 4
cctcctggag ctagttacgc tcaccacttg ggtttcgctg ggatgggaca 50
ggttcaggct ctgcctgctc ccagactcag tgcaccctta cctgtgcact 100
ccctttatgg acagcaaaga ccaagggggg aatccttttg ggattctccc 150
cctcctactg agtctcttga gggtttggct gccctagttc ggggtatggt 200
cagggatgag acaggtcgga ggtctccccc tcgtccttct cctcctcctc 250
ctcctcatgc tggtggaggg gtgtctgagc cttcaaggca acgtctgcaa 300
actc 304
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<212> DNA
<213>安吉小鲵Hynobius amjiensis 微卫星分子标记Hyam40
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ccctcctttt ccacttccat aaacaaaaac ggacattctg ctgctgctgc 50
tgctgctcat ggagccgcag tgcctcccct tacccaagag ggggcagtcg 100
ctaagctgtc ac 112
<210> 6
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<212> DNA
<213> 安吉小鲵Hynobius amjiensis 微卫星分子标记Hyam63
<400> 6
aaggtggccc caataatttc catgacctcg caaactgcct ggcagaagac 50
aaacacacac acacacactt taatttgaca ggtaaagtgt aaagtataaa 100
atctgggccg ctgacatttc tctagtccca cagattggct gtttctagga 150
tttgcttctt ttaactcaga tgcctatgta gtaggctgtg ggtcatattg 200
acagaatccc gttttgcaat gagcccaggt aaaag 235
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<212> DNA
<213>安吉小鲵Hynobius amjiensis 微卫星分子标记Hyam74
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gctctcctcc agactccctt ccaacctgaa gccttcaacc aactctctct 50
ctctctctct ctctctctct ctctctctct caagactaaa cagttccaga 100
attctagttg agataaaaac attctgtttc catgttgtgg tatcacaaca 150
catattagag atcctaaaag atgcttttgg aactctggga actctgagag 200
agttttctga tgagggaggc acacattttt caggggagaa acttccttct 250
aactcacacc ctgcctgatt caaggaaaa 279
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<212> DNA
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ctctgagcca gagctctctg taggattccc agtccctcca gaggccgcaa 250
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<212> DNA
<213>安吉小鲵Hynobius amjiensis 微卫星分子标记Hyam91
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aaccaacccg ttgtggggaa accctcagaa tctgcatatg ctttgtgata 100
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>特异引物序列Hyam26-R
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taaagtgaga cgtgggggtc 20
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