一种检测辅酶I中三氟乙酸的方法与流程

本发明涉及检测技术领域，且特别涉及一种检测辅酶i中三氟乙酸的方法。

背景技术

三氟乙酸(tfa)属于四类有机溶剂，在临床使用存在毒性，因此必须严格控制其中药品中的残留量，目前部分学者对药品中的tfa残留做了研究报道，但对辅酶i(nad)中的残留鲜有报道。

目前，对三氟乙酸的检测通常采用气相色谱检测方法或液相色谱检测方法，但是这两种方法均不能较好地检测出三氟乙酸的残留。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测辅酶i中三氟乙酸的方法，该方法能有效地检测出辅酶i中所含的三氟乙酸。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种检测辅酶i中三氟乙酸的方法，包括：利用淋洗液将辅酶i带入离子色谱柱的保护柱中，经保护柱处理后将辅酶i输送至离子色谱柱的分析柱中，经保护柱处理后的辅酶i进入分析柱处理，然后进入抑制器处理后由电导检测器进行电导检测；淋洗液为碳酸钠和碳酸氢钠的混合溶液。

进一步地，在本发明的一种实施例中：

混合溶液的体积浓度为1.8～2.2％。

进一步地，在本发明的一种实施例中：

混合溶液的体积浓度为2％。

进一步地，在本发明的一种实施例中：

碳酸钠和碳酸氢钠的体积比为6-10:3。

进一步地，在本发明的一种实施例中：

碳酸钠和碳酸氢钠的体积比为7-9:3。

进一步地，在本发明的一种实施例中：

淋洗液的进料速度为0.8-1.2ml/min。

进一步地，在本发明的一种实施例中：

淋洗液的进料速度为1ml/min。

进一步地，在本发明的一种实施例中：

先将辅酶i与超纯水混合稀释，将稀释后的辅酶i过滤膜及rp柱，然后由淋洗液将辅酶i带入离子色谱柱的保护柱中。

进一步地，在本发明的一种实施例中：

滤膜的孔径为0.2-0.25mm。

本发明实施例的有益效果是：本公开的一种检测辅酶i中三氟乙酸的方法，利用弱碱性的碳酸钠和碳酸氢钠配置而成的淋洗液，抑制器可降低流动相的背景，，辅酶i和淋洗液经保护柱处理后进入分析柱内，利用电导检测器进行电导检测，从而提高辅酶i中三氟乙酸的检测灵敏度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为对照组测试得到的色谱图；

图2为实施例1测试得到的色谱图；

图3为实施例2测试得到的色谱图；

图4为实施例3测试得到的色谱图；

图5为实施例4测试得到的色谱图；

图6为对比例1中样品溶液测试得到的色谱图；

图7为对比例1中空白溶剂测试得到的色谱图；

图8为对比例2中样品溶液测试得到的色谱图；

图9为对比例2中空白溶剂测试得到的色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。离子色谱仪的型号为ics600。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种检测辅酶i中三氟乙酸的方法进行具体说明。

辅酶i(nad)，化学名为烟酰胺腺嘌呤二核甘酸或二磷酸烟苷。辅酶i是人体氧化还原反应中重要的辅酶，出现在细胞很多代谢反应中。作为生物催化反应必不可少的辅酶，参与上千种生理反应，如细胞三羧酸循环(tca)、脂肪β氧化等，在糖、脂肪、氨基酸等营养物质的代谢利用过程中具有重要意义。

三氟乙酸(tfa)是一种强羧酸，pka＝0.23，能够刺激人体组织和皮肤。虽有轻微的毒性，但是在不流动的地表水中富集则会影响农业和水生系统，并且tfa经历微生物降解产生温室气体chf3，达到一定浓度后，会对人体产生危害。

辅酶i中残留三氟乙酸会对人体造成一定伤害。因此，有必要对检测辅酶i中是否残留有三氟乙酸。目前，对三氟乙酸的检测通常采用气相色谱检测方法或液相色谱检测方法，但是这两种方法均不能较好地检测出三氟乙酸的残留。

基于此，本申请提供一种检测辅酶i中三氟乙酸的方法，包括：利用淋洗液将辅酶i带入离子色谱柱的保护柱中，经保护柱处理后将辅酶i输送至离子色谱柱的分析柱中，经保护柱处理后的辅酶i进入分析柱处理，然后进入抑制器处理后由电导检测器进行电导检测；淋洗液为碳酸钠和碳酸氢钠的混合溶液。

本公开的一种检测辅酶i中三氟乙酸的方法，利用弱碱性的碳酸钠和碳酸氢钠配置而成的淋洗液，抑制器可降低流动相的背景，辅酶i和淋洗液经保护柱处理后进入分析柱内，利用电导检测器进行电导检测，从而提高辅酶i中三氟乙酸的检测灵敏度。

需要说明的是，由于气相色谱检测方法中所用的fid检测器(氢离子火焰检测器)是检测碳氢化合物的，而三氟乙酸仅含有两个c，一个h，测残留量根本检测不出来。液相色谱检测方法中，三氟乙酸检测限比较高，残留量很小的情况下达不到其检测限，检测不出来。因而，在本实施方式中，所用的电导检测器为电子俘获检测器(ecd)。

进一步地，在一些实施方式中，混合溶液的体积浓度为1.8～2.2％。在一些实施方式中，混合溶液的体积浓度为2％。

进一步地，在一些实施方式中，碳酸钠和碳酸氢钠的体积比为6-10:3。在一些实施方式中，碳酸钠和碳酸氢钠的体积比为7-9:3。该比例范围的碳酸钠和碳酸氢钠能使得混合溶液处于合适的碱性范围，有利于降低淋洗液本身的电导。

进一步地，在一些实施方式中，淋洗液的进料速度为0.8-1.2ml/min。在一些实施方式中，淋洗液的进料速度为1ml/min。

进一步地，在一些实施方式中，先将辅酶i与超纯水混合稀释，将稀释后的辅酶i过滤膜及rp柱，然后由淋洗液将辅酶i带入离子色谱柱的保护柱中。

由于辅酶i中可能含有强保留组分或者其他弱极性化合物时，将辅酶i稀释后经滤膜和rp柱可有效去除这些物质，可以降低基体对测定的影响。在一些实施方式中，滤膜的孔径为0.2-0.25mm。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

吸取1ml的样品辅酶i置于50ml的量瓶中，加超纯水将其稀释至50ml得到初品溶液，吸取1ml初品溶液置于50ml量瓶中，加超纯水稀释至50ml得到样品溶液，将样品溶液过孔径为0.22mm的滤膜后再注入rp柱。

离子色谱条件：离子色谱仪的型号为ics600，淋洗液为体积比为7：3的碳酸钠和碳酸氢钠的混合溶液，混合溶液的体积浓度为2％；淋洗液的流速为1ml/min；分析柱柱温30℃。

按照上述离子色谱条件进行测试：利用淋洗液将辅酶i带入离子色谱柱的保护柱中，经保护柱处理后将辅酶i输送至离子色谱柱的分析柱中，经保护柱处理后的辅酶i进入分析柱处理，然后进入抑制器处理后由电导检测器进行电导检测。

实施例2

吸取5ml的样品辅酶i过孔径为0.22mm的滤膜后再注入rp柱。

离子色谱条件：离子色谱仪的型号为ics600，淋洗液为体积比为3：1的碳酸钠和碳酸氢钠的混合溶液，混合溶液的体积浓度为1.8％；淋洗液的流速为1.2ml/min；分析柱柱温30℃。

按照上述离子色谱条件进行测试：利用淋洗液将辅酶i带入离子色谱柱的保护柱中，经保护柱处理后将辅酶i输送至离子色谱柱的分析柱中，经保护柱处理后的辅酶i进入分析柱处理，然后进入抑制器处理后由电导检测器进行电导检测。

实施例3

吸取5ml的样品辅酶i置于25ml的量瓶中，加超纯水将其稀释至25ml得到样品溶液，将样品溶液过孔径为0.25mm的滤膜后再注入rp柱。

离子色谱条件：离子色谱仪的型号为ics600，淋洗液为体积比为10：3的碳酸钠和碳酸氢钠的混合溶液，混合溶液的体积浓度为2.2％；淋洗液的流速为0.8ml/min；分析柱柱温30℃。

按照上述离子色谱条件进行测试：利用淋洗液将辅酶i带入离子色谱柱的保护柱中，经保护柱处理后将辅酶i输送至离子色谱柱的分析柱中，经保护柱处理后的辅酶i进入分析柱处理，然后进入抑制器处理后由电导检测器进行电导检测。

实施例4

取250mg的粉末样品辅酶i置于25ml的量瓶中，加超纯水将其稀释至25ml得到样品溶液，将样品溶液过孔径为0.22mm的滤膜后再注入rp柱。

离子色谱条件：离子色谱仪的型号为ics600，淋洗液为体积比为2：1的碳酸钠和碳酸氢钠的混合溶液，混合溶液的体积浓度为2％；淋洗液的流速为1ml/min；分析柱柱温30℃。

按照上述离子色谱条件进行测试：利用淋洗液将辅酶i带入离子色谱柱的保护柱中，经保护柱处理后将辅酶i输送至离子色谱柱的分析柱中，经保护柱处理后的辅酶i进入分析柱处理，然后进入抑制器处理后由电导检测器进行电导检测。

对比例1

利用气相色谱检测方法对辅酶i中的三氟乙酸进行检测：

1)空白溶剂：超纯水。

2)样品溶液的配制：取0.1g辅酶i供试品，精密称定，置25ml容量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度线，摇匀即得。

色谱条件：以db-5ms(或极性相近)为固定的毛细管柱，30m×0.53mm×1.0μm；采用氢火焰离子化检测器(fid)。载气：氮气；柱温80℃维持18mim，进样口温度120℃，检测器180℃；进样量：空白溶剂和样品溶液0.2μll、三氟乙酸2μl；流速：4ml/min；分流比：10：1。

对比例2

利用气相色谱检测方法对辅酶i中的三氟乙酸进行检测：

1)空白溶剂：超纯水。

2)样品溶液的配制：取0.1g辅酶i供试品，精密称定，置25ml容量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度线，摇匀即得。

色谱条件：以db-5ms(或极性相近)为固定的毛细管柱，30m×0.53mm×1.0μm；采用氢火焰离子化检测器(fid)。载气：氮气；柱温80℃维持18mim，进样口温度120℃，检测器180℃；进样量：空白溶剂和样品溶液0.2μll、三氟乙酸2μl；流速：4ml/min；分流比：10：1。

对比例3

利用液相色谱检测方法对辅酶i中的三氟乙酸进行检测：

空白溶剂：流动相

色谱条件：

色谱柱：c18柱；检测波长：210nm；流动相：质量浓度为0.07％的磷酸溶液(ph3.0)-甲醇(98:2)；流速1.0ml/min；柱温：30℃；对照品溶液浓度：10μl/ml；样品溶液：fm17013冻干前浓缩液稀释10倍。

对照组

吸取三氟乙酸标准品储备液(1000ppm)适量，加超纯水稀释制成三氟乙酸含量为2ppm作为标准品溶液。

离子色谱条件同实施例1，测试方法也同实施例1。

试验例1

将实施例3的样品溶液(本底)与三氟乙酸溶液(加样量)混合进行色谱测试得到三氟乙酸的测得量，然后计算精确度＝(测得量-本底)/加样量。其结果记录在表1中。

表1实施例3的检测辅酶i中三氟乙酸的方法的检测精确度

从表1的结果可以看出，实施例3的检测辅酶i中三氟乙酸的方法的检测精确较高，误差较小。

试验例2

将实施例1-4及对照组测试得到的色谱图进行比较。

其中，图1为对照组测试得到的色谱图；图2为实施例1测试得到的色谱图；图3为实施例2测试得到的色谱图；图4为实施例3测试得到的色谱图；图5为实施例4测试得到的色谱图。通过对图1-图5的结果进行分析，得到的测定结果如表2和表3。表2示出了实施例1-4的样品检测结果。表3为三氟乙酸的标准曲线相关系数。其中，三氟乙酸浓度为通过本发明实施例测得的三氟乙酸浓度，样品中三氟乙酸浓度＝三氟乙酸浓度*稀释倍数。

表2实施例1-4的样品检测结果

从表2的结果可以看出，即使是三氟乙酸的含量为0.015mg/l，本实施例的检测辅酶i中三氟乙酸的方法也能将三氟乙酸检测出，检出限较低，能够有效地检测出辅酶i中的三氟乙酸。

表3三氟乙酸的标准曲线相关系数

试验例3

将对比例1-2测试得到的色谱图进行分析：

(1)请参照图6和图7，对比例1中，空白溶剂(超纯水)出峰时间与三氟乙酸出峰时间有重叠部分，所以此种方法检测空白有干扰，无法判断样品里三氟乙酸残留情况。

(2)请参照图8和图9，对比例2中，空白溶剂(超纯水)出峰时间仍然与三氟乙酸出峰时间完全重叠，所以此种方法检测空白有干扰，无法判断样品里三氟乙酸残留情况。

(3)经测试，对比例3的峰型不是特别好，峰前有小杂峰，未完全分开，无法准确判断样品里三氟乙酸残留情况。

综上所述，本发明实施例的一种检测辅酶i中三氟乙酸的方法，利用弱碱性的碳酸钠和碳酸氢钠配置而成的淋洗液，抑制器可降低流动相的背景，，辅酶i和淋洗液经保护柱处理后进入分析柱内，利用电导检测器进行电导检测，从而提高辅酶i中三氟乙酸的检测灵敏度。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。