本发明涉及临床体外检测技术领域，特别涉及一种准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂。
背景技术
高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)可通俗地理解为"好"胆固醇，抗动脉粥样硬化,可减少患冠状动脉心脏病的危险。高密度脂蛋白胆固醇主要是由肝脏合成,与乳糜微粒(cm)、极低密度脂蛋白(vldl)和低密度脂蛋白(ldl)相比，高密度脂蛋白(hdl)是密度最大的脂蛋白(d=1.063～1.210kg/l)。其组分中蛋白质(pro)、磷脂(pl)、胆固醇(chol)和甘油三酯(tg)各约占50%、25%、20%和5%。hdl中pro主要是载脂蛋白(apo)ai和aii；chol占总胆固醇(tc)的25%～35%，酯化胆固醇(ce)和游离胆固醇(fc)之比约为3∶1。hdl可通过酶和受体的作用，将周围组织的chol移至肝脏降解处理，同时抑制细胞结合和摄取ldl-c，阻止chol在动脉壁的沉积，故hdl被认为是as的预防因子。
血液中各种脂蛋白种类很多，包括乳糜微粒(cm)、极低密度脂蛋白(vldl)和低密度脂蛋白(ldl)等各种物质，在测定血清hdl-c时需要需根据各种脂蛋白的密度、颗粒大小、电荷等应用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将hdl与其他脂蛋白分离开,再测定hdl组分中胆固醇含量。美国疾病控制与预防中心(cdc)测定hdl-c的参考方法(rm法)为超速离心法,也为ncep所推荐。国外把临床常规实验室直接分离测定hdl-c的方法分为3代。第1代为化学沉淀法,常用的沉淀剂为多聚阴离子,如磷钨酸(pta)、ds、肝素或非离子多聚体如聚乙二醇与某些两价阳离子(如mg2+、ca2+、mn2+)合用。最早为美国国立卫生研究院(nih)所采用的肝素-锰沉淀法,后多采用ds50-mg2+法,欧洲则多采用磷钨酸镁沉淀法(pta-mg2+法)和聚乙二醇沉淀法(peg法)。但此类方法受高三酰甘油(tg)的影响。第2代采用简便的磁珠ds-mg2+分离法,省去了离心步骤,但需特殊装置,试剂不适用于推广应用。第3代为匀相测定法,标本用量少,不需沉淀处理,可用自动生化分析仪测定,在准确度和精密度方面都有较大的改进，目前使用较广泛。均相法检测血高密度脂蛋白胆固醇的方法中也包含众多的方法，其中包含选择性抑制法、peg修饰酶法、清除法、免疫分离法等等众多方法，其中选择性抑制法出现的最早，但是本方法存在抑制剂效果差，特异性不强等问题；peg修饰酶法准确性较高，但是本方法需要将参与反应中的酶提前使用peg修饰，并且难度较大，所修饰酶的活性也不易控制，因此存在较大技术难度，而免疫分离法则操作较复杂，不利于全自动推广；清除法是目前均相法检测高密度脂蛋白胆固醇方法中使用最广泛的方法，其主要的原理为将hdl-c以外的脂类进行激活暴露，然后加入胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶进行反应，生成的h2o2,被过氧化氢酶或者过氧化物酶进行清除，然后在r2中加入适当的hdl-c激活剂进行激活，单独检测hdl-c的含量，本方法需要选择应用特异性非常强的物质对hdl-c进行抑制和对其他脂类物质进行激活，这种方法实际操作过程中存在较大的偏差，其根本原因就在于第一步反应中容易对hdl-c进行消耗或者对其他的脂类物质清除不够。基于清除法这些缺陷，本发明研究出一种不使用酶反应，直接清除hdl-c以外的其他脂类物质，然后在第二步反应中检测hdl-c的含量，本方法准确度高，且省去第一步中酶的参与，降低产品成本。
技术实现要素：
本发明涉及一种准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂。
检测原理：
首先在r1试剂中加入分别针对于乳糜微粒(cm)、极低密度脂蛋白(vldl)和低密度脂蛋白(ldl)、甘油等干扰物质对应的准确度高的去干扰剂，将hdl-c以外的其他物质全部清除掉,然后加入试剂r2,在一种特殊的选择性表面活性剂作用下,激活hdl-c颗粒成为可溶,所释放的胆固醇与胆固醇酯酶（cher）和胆固醇氧化酶（chod）反应,生成h2o2,然后借助trinder反应进行显色反应。
一种准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂组成成分如下：
本发明是通过以下步骤得到的：
试剂r1：
缓冲液100mmol/l
抗坏血酸氧化酶200u/l-1000u/l
肝素2mmol/l-5mmol/l
无水.氯化钙3g/l-5g/l
磷钨酸0.2/l-0.8/l
吐温-205ml/l-7.5ml/l
表面活性剂11g/l-3g/l
表面活性剂21mmol/l-5mmol/l
色原0.1g/l-0.3g/l
防腐剂0.5ml/l-1ml/l
试剂r2：
缓冲液100mmol/l
保护剂5g/l-10g/l
胆固醇酯酶（cher）2ku/l-3ku/l
胆固醇氧化酶(chor)0.5ku/l-1ku/l
过氧化物酶2ku/l-5ku/l
表面活性剂2ml/l-3ml/l
4-aa1mmol/l-2mmol/l
防腐剂0.5ml/l-1ml/l。
所述的一种准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂，试剂r1、r2中缓冲液为25℃，ph=6.8的浓度为100mmol/l的pipes–pipesna1.5(1,4-哌嗪二乙磺酸倍半钠盐)缓冲液。
所述的一种准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂，试剂r1、r2中所述防腐剂为pc-300。
所述的一种准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂，试剂r1所述表面活性剂1为对甲基苯甲醚(sigma)。
所述的一种准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂，试剂r1所述表面活性剂2为十八烷基三甲基碘化铵(sigma)。
所述的一种准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂，试剂r1所述色原todp（3-甲基-n,n-二丙磺酸钠苯胺）（上海西宝生物）。
所述的一种准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂，试剂r2所述保护剂为小牛血清白蛋白。
所述的一种准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂，试剂r2所述表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚-7（np-7）。
所述的一种准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂，使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为546nm。
所述的试剂为液态双试剂，试剂r1、r2使用比例为3:1。
本发明的创新之处如下：
1）本发明为双试剂，使用浓度为100mmol/l的ph=6.8的pipes–pipesna1.5缓冲体系，并且缓冲体系中优先选择了pc-300作为防腐剂；
2）在试剂1中为了高效的去除hdl-c以外乳糜微粒(cm)、极低密度脂蛋白(vldl)和低密度脂蛋白(ldl)三种物质，在试剂中选择了肝素、磷钨酸、和氯化钙作为螯合沉淀剂，并且在试剂中选择添加了对甲基苯甲醚和十八烷基三甲基氯化铵作为溶解变性剂，能有效的去除形成的沉淀物，防止试剂产生浑浊；
3）在试剂1中吐温-20的添加可以有效去除高浓度甘油的干扰，抗坏血酸氧化酶的添加能够有效去除抗坏血酸对trinder反应的干扰；
4）试剂r2表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚-7（np-7）的选择，则可较好激活hdl-c的活性，促进其反应，可以降低酶的使用量。
附图说明
图1实施例2和实施例3试剂检测方法；
图2实施例2、实施例3试剂分别与实施例1试剂40个样本检测结果的比较；
图3实施例2试剂与实施例1试剂相关性曲线图；
图4实施例3试剂与实施例1试剂相关性曲线图。
图5实施例2和实施例3试剂抗干扰能力验证结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
本实施例描述的是一种cdc指定的比较方法硫酸葡聚糖-mg沉淀法检测hdl-c的方法：
原理：以硫酸葡聚糖ds50与镁离子沉淀血清中apob的脂蛋白（ldl、vldl、lp(a)）,测定上清液中的hdl-c。
ds沉淀试剂：称取硫酸葡聚糖ds501.0g、六水合氯化镁10.16g及叠氮钠50mg,溶于去离子水中，定量至100ml,此试剂在室温中至少可稳定1年。
hdl-c的检测同等于albk法测定tc方法
操作：血清0.5ml与ds沉淀试剂50ul混合，放置在室温5-30min,离心12000转5min,然后检测上清液中的hdl-c的含量。
计算方式：hdl-c(mmol/l)等于测定管a除以标准管a乘以校准血清的胆固醇。
实施例2
本实施例描述的是一种准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的配方：
试剂r1：
pipes–pipesna1.5缓冲液100mmol/l
抗坏血酸氧化酶200u/l
肝素2mmol/l
无水氯化钙3g/l
磷钨酸0.2/l
吐温-205ml/l
对甲基苯甲醚1g/l
十八烷基三甲基氯化铵1mmol/l
todp0.1g/l
pc-3000.5ml/l
试剂r2：
pipes–pipesna1.5缓冲液100mmol/l
小牛血清白蛋白5g/l
胆固醇酯酶（cher）2ku/l
胆固醇氧化酶(chor)0.5ku/l
过氧化物酶2ku/l
壬基酚聚氧乙烯醚-7（np-7）2ml/l
4-aa1mmol/l
pc-3000.5ml/l
实施例3
本实施例所描述的是一种关键原材料增加后的准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂配方；
试剂r1：
pipes–pipesna1.5缓冲液100mmol/l
抗坏血酸氧化酶1000u/l
肝素5mmol/l
无水氯化钙5g/l
磷钨酸0.8/l
吐温-207.5ml/l
对甲基苯甲醚3g/l
十八烷基三甲基氯化铵5mmol/l
todp0.3g/l
pc-3001ml/l
试剂r2：
pipes–pipesna1.5缓冲液100mmol/l
小牛血清白蛋白10g/l
胆固醇酯酶（cher）3ku/l
胆固醇氧化酶(chor)1ku/l
过氧化物酶5ku/l
壬基酚聚氧乙烯醚-7（np-7）3ml/l
4-aa2mmol/l
pc-3001ml/l
实施例4
1）本实施例描述的是将实施例2、实施例3试剂采用cdc指定的比较方法硫酸葡聚糖-mg沉淀法进行同步检测，与实施例1对比检测结果。
2）本实施例试剂的使用方法：
将实施例2和实施3所描述的高密度脂蛋白胆固醇试剂检测方案，配制成液态试剂，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用终点法进行测定。将r1和r2按照3:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作方法见图1。
将实施例2、实施3试剂和实施例1采用cdc指定的比较方法（硫酸葡聚糖-mg沉淀法），进行40个临床样本的检测比对，检测结果见图2、图3、图4。通过结果可知，实施例2、实施3试剂和实施例1的相对偏差在10%以内，相关系数分别为：r1=0.9992和r2=0.9994，具有非常好的相关性。
实施例5
干扰性试验：取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到图5的要求。然后分别用实施例2和实施例3中所得试剂测定血清或血浆中的高密度脂蛋白胆固醇的含量，对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见图5。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。
由图5可以看出，实施例2、实施例3试剂使用抗坏血酸≤5000μmol/l、甘油三酯≤22.6mmol/l、血红蛋白≤2000mg/dl、胆红素≤684μmol/l、低密度脂蛋白胆固醇≤12mmol/l、极低密度脂蛋白胆固醇≤3.5mmol/l、乳糜微粒≤7.5mmol/l时对测试结果没有明显干扰，而现有的hdl-c检测试剂则对于所提到的干扰物质则有不同程度的干扰，说明本发明的hdl-c检测试剂具有良好的抗干扰能力。