本发明属于药物活性检测方法技术领域，具体涉及一种测定抗vegf抗体活性的方法的建立及其应用。
背景技术
肿瘤是一种血管生成依赖性疾病，肿瘤的生长离不开血管及血液的供应。肿瘤血管靶向治疗(tumorvasculartargetingtherapy)逐步发展成为当今肿瘤领域研究的主攻方向之一。肿瘤组织产生血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)，与血管内皮细胞上的受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，vegfr)结合后，能够通过胞内信号转导系统促进血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成以及微血管通透性，并诱导血管生成，维持肿瘤的继续生长。vegf是目前发现的功能最重要的血管生长因子，与诸多生理及病理过程有关。已有研究表明，多种实体瘤中存在vegf的过表达，这使得vegf成为肿瘤治疗的靶点。
目前vegf主要有5大类，分别为vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d、以及plgf。而vegf的受体(vegfr)分为三类，分别为位于造血干细胞的vegfr1、位于血管内皮细胞的vegfr2和位于淋巴内皮细胞的vegfr3。vegf-vegfr信号通路的相关抗体或融合蛋白通过与vegf的结合，进而阻止vegf与其受体进行结合，进而阻止其功能的发挥。抗vegf抗体主要有贝伐珠单抗(bevacizumab，avastin)、vegftrap(aflibercept，eylea)、雷莫芦单抗(ramucirumab，cyramza)及雷珠单抗(ranibizumab,lucentis)等等。
其中，贝伐珠单抗是由美国基因泰克公司(genentech)研发的一种重组人源化igg1单克隆抗体，能够高亲和力地选择性结合vegf，通过空间位阻阻断vegf与其血管内皮细胞表面上的受体flt-1(vegfr-1)和kdr(vegfr-2)结合，从而中和了vegf的生物学活性，特异性抑制肿瘤血管生成，从而阻止肿瘤的生长和转移。作为世界首个抗vegf的抗体药物，贝伐珠单抗已经被国际权威的nccn推荐为多种转移性肿瘤的一线治疗药物，在全球转移性癌症患者中得到广泛应用。eylea(aflibercept)是一种由人vegfr-1和2细胞外结构区部分融合至人igg1的fc部分组成的重组融合蛋白，其作用如同可溶性诱饵受体[decoyreceptor]与vegf-a和plgf结合，抑制其vegf受体结合和激活。雷莫芦单抗是抗vegfr2的人源单克隆抗体。雷珠单抗是靶向vegf的fab抗体片段。
生物学活性是上述治疗类抗体质量性能参数中一个关键指标，为了对此治疗性抗体进行有效的质量控制，首先要建立切实可行的测定其生物学活性的方法。传统的检测抗vegf抗体的方法是利用vegf能够刺激huvec细胞增殖，而抗vegf单抗可通过结合vegf来抑制huvec细胞增殖的原理进行检测。但由于huvec为原代贴壁细胞，生长周期慢，整个实验过程需要72小时，检测时间长、灵敏度低。
技术实现要素：
基于此，有必要提供一种快速且灵敏度高的测定抗vegf抗体活性的方法。
一种测定抗vegf抗体活性的方法，包括如下步骤：
提供转染了vegf受体、il-1r3、il-1r6以及报告基因的效应细胞；
用anti-cd3抗体和anti-cd28抗体激活所述效应细胞；
向激活后的所述效应细胞中加入vegf配体，其中，所述vegf配体能够与所述vegf受体结合，促使所述效应细胞内的il-1r3和il-1r6相互作用并表达所述报告基因；及
加入待测抗vegf抗体以阻断所述vegf配体与所述vegf受体结合，根据所述抗vegf抗体的加入量与所述报告基因表达量的参数曲线确定所述待测抗vegf抗体的活性。
在一个实施方式中，所述加入待测抗vegf抗体以阻断所述vegf配体与所述vegf受体结合的操作之前，还包括：
向激活后的所述效应细胞中加入vegf配体，并加入梯度已知浓度的抗vegf抗体以阻断所述vegf配体与所述vegf抗体结合，获得各个浓度的所述抗vegf抗体对应的报告基因表达量；及
建立所述抗vegf抗体的加入量与所述报告基因表达量的参数曲线。
在一个实施方式中，所述转染了vegf受体、il-1r3、il-1r6以及报告基因的效应细胞通过如下方法构建得到：
用含有报告基因的载体转染宿主细胞，获得含有报告基因的宿主细胞；及
向所述含有报告基因的宿主细胞中转染第一载体和第二载体，其中所述第一载体中含有vegf受体以及il-1r3基因，所述第二载体中含有vegf受体以及il-1r6基因，并加入抗性标记物筛选获得稳定表达vegf受体、il-1r3、il-1r6以及报告基因的宿主细胞，得到所述效应细胞。
在一个实施方式中，所述宿主细胞为悬浮生长细胞。
在一个实施方式中，所述vegf受体为vegfr2。
在一个实施方式中，所述抗性标记物选自g481和zeo中的至少一种。
在一个实施方式中，所述报告基因具体为荧光素酶报告基因。
在一个实施方式中，所述vegf配体选自vegf-165和pigf中的至少一种。
在一个实施方式中，所述抗vegf抗体选自贝伐珠单抗、vegftrap、雷莫芦单抗及雷珠单抗中的至少一种。
在一个实施方式中，所述用anti-cd3抗体和anti-cd28抗体激活所述效应细胞的操作之前，还包括将所述效应细胞制备成细胞悬液，所述细胞悬液的的浓度为1×104个/孔～1×106个/孔。
上述测定抗vegf抗体活性的方法，用转染了vegf受体、il-1r3、il-1r6以及报告基因的效应细胞作为检测材料，再由anti-cd3抗体和anti-cd28抗体激活jurkat细胞，然后加入vegf配体，vegf配体通过与效应细胞上的vegf受体(vegfr)的结合，使得细胞内的il-1r3和il-1r6相互作用，进而激活下游的nfat信号通路，nfat蛋白进入细胞核进而与nfat-re结合，使得报告基因得以表达。报告基因的表达量强弱与vegf配体与vegf受体的结合呈正相关。当加入抗vegf抗体后，抗vegf抗体能够竞争性的与vegf配体结合，阻断vegf配体与其受体vegfr的结合，造成下游的报告基因表达量的减少。因此，抗vegf抗体的加入量与报告基因表达量之间的关系可以拟合形成参数曲线。当检测未知活性的待测抗vegf抗体时，先获得待测抗vegf抗体对应地报告基因表达量，将该报告基因表达量带入该参数曲线中即可确定待测抗vegf抗体的活性。该方法操作步骤更为简便，整个实验只需要6小时左右，大大缩短了实验时间，并且利用报告基因来检测，增强了检测方法的灵敏度和准确性。
附图说明
图1为测定抗vegf抗体活性的方法的原理图；
图2为实施例1中不同克隆的效应细胞荧光素酶活性测定结果图；
图3为vegfr-nfat-jurkat-1-2细胞在不同vegf-165浓度下的荧光值曲线图；
图4是vegfr-nfat-jurkat-1-2细胞在不同抗体浓度下的荧光值曲线图；
图5是vegfr-nfat-jurkat-1-2细胞在不同细胞密度下的荧光值曲线图；
图6是实施例3中测定四种单抗药物活性结果比较图；
图7是实施例3转基因细胞法和增殖抑制法测定药物活性的结果比较图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一种测定抗vegf抗体活性的方法，包括如下步骤s110～s140。
s110、提供转染了vegf受体、il-1r3、il-1r6以及报告基因的效应细胞。
具体地，用含有报告基因的载体转染宿主细胞，获得含有报告基因的宿主细胞，再向向含有报告基因的宿主细胞中转染第一载体和第二载体，其中所述第一载体中含有vegf受体以及il-1r3基因，第二载体中含有vegf受体以及il-1r6基因，并加入抗性标记物筛选获得稳定表达vegf受体、il-1r3、il-1r6以及报告基因的宿主细胞，得到效应细胞。
具体地，宿主细胞为悬浮生长细胞。悬浮生长地细胞容易培养，生长周期短，利于实现快速检测。
具体地，宿主细胞可以为jurkat细胞、cho细胞或293细胞等。优选地，宿主细胞为jurkat细胞。
具体地，vegf受体可以为vegfr1或者vegfr2。vegfr1的氨基酸序列如seqno.1所示，vegfr2的氨基酸序列如seqno.2所示。
优选vegf受体为vegfr2。vegf-vegfr信号通路的抑制剂种类繁多，机理稍有差异，vegfr2-nfat-jurkat系统比vegfr1-nfat-jurkat系统更具有实用性，可用于如贝伐珠单抗、vegftrap、雷莫芦单抗及雷珠单抗的生物活性检测，而vegfr1-nfat-jurkat适用于贝伐珠单抗及雷珠单抗的生物活性检测。
本实施方式中，报告基因具体为荧光素酶报告基因。荧光素酶能够在底物的作用下发出荧光信号，根据检测荧光信号的强弱实现定量化的检测。
本实施方式中，抗性标记物可选自g481和zeo中的至少一种。通过抗性筛选，获得稳定表达vegf受体、il-1r3、il-1r6以及报告基因的效应细胞。
构建效应细胞后，将效应细胞制备成细胞悬液，便于下一步地检测。优选地，细胞悬液的的浓度为1×104个/孔～1×106个/孔。
s120、用anti-cd3抗体和anti-cd28抗体激活所述效应细胞；
具体地，采用anti-cd3抗体和anti-cd28抗体包被效应细胞过夜，以激活效应细胞。
s130、向激活后的效应细胞中加入vegf配体，其中，vegf配体能够与效应细胞上的vegf结合，促使效应细胞内的il-1r3和il-1r6相互作用并表达报告基因。
具体地，vegf配体可以选自vegf-165和pigf中的至少一种。当然，在其他实施方式中，vegf配体还可以为vegf115、vegf121、vegf145、vegf189、vegf206等。
本实施方式中，il-1r3的氨基酸序列如seqno.3所示，il-1r6的氨基酸序列如seqno.4所示。
s140、加入待测抗vegf抗体以阻断vegf配体与vegf结合，并根据抗vegf抗体的加入量与报告基因表达量的参数曲线确定待测抗vegf抗体的活性。
具体地加入待测抗vegf抗体以阻断所述vegf配体与所述vegf结合的操作之前，还包括：向激活后的效应细胞中加入vegf配体，并加入梯度已知浓度的抗vegf抗体以阻断vegf配体与所述vegf结合，获得各个浓度的抗vegf抗体对应的报告基因表达量，建立抗vegf抗体的加入量与报告基因表达量的参数曲线。当然，如果已经建立了抗vegf抗体的加入量与报告基因表达量的参数曲线，则这一步骤可以省略。
具体地，报告基因表达量通过荧光信号的强弱来评估。
如图1所示，anti-cd3抗体和anti-cd28抗体激活效应细胞后，然后加入配体vegf-165或pigf，配体通过与vegfr的结合，使得细胞内的il-1r3和il-1r6相互作用，进而激活下游的nfat信号通路，nfat蛋白进入细胞核进而与nfat-re结合，使得荧光素酶蛋白得以表达，加入荧光素酶底物，通过酶标仪对荧光信号进行记录。荧光信号的强弱与配体vegf-165或pigf与vegfr的结合呈正相关。进一步地，当使用抗vegf抗体，抗vegf抗体与配体vegf结合后，阻断vegf与其受体vegfr的结合，造成下游的荧光素酶蛋白表达量的减少，酶标仪检测的荧光信号减弱。
具体地，抗vegf抗体选自贝伐珠单抗、vegftrap、雷莫芦单抗及雷珠单抗中的至少一种。
实施例1构建稳定表达vegfr-luciferase的jurkat细胞株
1.1实验材料
本检测系统所需的试验耗材如下：含有nfat-luciferase报告基因的nfat-jurkat细胞由购买于promega公司的jurkat细胞，转入nfat-luciferase报告基因后，经筛选稳定细胞株获得。pcdna3.1[g418]和pcdna3.1[zeo]质粒来源于通用生物系统(安徽)有限公司。vegfr-il1r序列合成于通用生物系统(安徽)有限公司。活性用重组人血管内皮生长因子-165(vegf-165)购买于北京义翘神州科技有限公司。bio-glo荧光素酶试剂盒购买于promega公司。
1.2质粒转染
分为两组：
第一组：采用neontm电穿孔转染系统(invitrogen)对nfat-jurkat细胞进行pcdna3.1[vegfr1-il1r3/g418]和pcdna3.1[vegfr1-il1r6/zeo]质粒的共转染。其中，vegfr1的氨基酸序列如seqno.1所示，il-1r3的氨基酸序列如seqno.3所示，il-1r6的氨基酸序列如seqno.4所示。转染48小时后，在培养液中加入300μg/ml的g418和200μg/ml的zeo进行加压筛选。待细胞密度和活力恢复后，通过有限稀释法，按照0.5cell/孔的密度，铺96孔板筛选单克隆。在细胞生长期间，观察并标记那些孔是单克隆，当单克隆孔内vegfr1-nfat-jurkat细胞汇合度达到30％以上时，将此孔内细胞转移至24孔板，逐步扩大培养。
第二组：采用neontm电穿孔转染系统(invitrogen)对nfat-jurkat细胞进行pcdna3.1[vegfr2-il1r3/g418]和pcdna3.1[vegfr2-il1r6/zeo]质粒的共转染。其中，vegfr2的氨基酸序列如seqno.2所示，il-1r3的氨基酸序列如seqno.3所示，il-1r6的氨基酸序列如seqno.4所示。转染48小时后，在培养液中同时加入300μg/ml的g418和200μg/ml的zeo进行加压筛选。待细胞密度和活力恢复后，通过有限稀释法，按照0.5cell/孔的密度，铺96孔板筛选单克隆。在细胞生长期间，观察并标记那些孔是单克隆，当单克隆孔内vegfr2-nfat-jurkat细胞汇合度达到30％以上时，将此孔内细胞转移至24孔板，逐步扩大培养。
1.3vegfr-nfat-jurkat细胞株筛选
为了比较vegfr1-nfat-jurkat细胞株和vegfr2-nfat-jurkat细胞株对vegf-165细胞因子的灵敏度，通过vegf-165细胞因子刺激2种细胞，根据荧光信号的差异，选择vegfr2-nfat-jurkat细胞株为工程株。
筛选：anti-cd3抗体和anti-cd28抗体包被96孔白板4℃过夜，每孔加入20000个不同株的vegfr2-nfat-jurkat细胞，vegf-165稀释至100ng/ml，1：2稀释11个浓度梯度，37℃，5％co2培养箱6小时，每孔加50μl荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。
经过筛选，vegfr2-nfat-jurkat-1-2细胞对vegf-165的刺激有较好荧光素酶表达反应性(见图2)，选取vegfr2-nfat-jurkat-1-2细胞为实验用细胞。因为vegf-vegfr信号通路的抑制剂种类繁多，机理稍有差异，vegfr2-nfat-jurkat系统比vegfr1-nfat-jurkat系统更具有实用性，vegfr2-nfat-jurkat可用于如贝伐珠单抗、vegftrap、雷莫芦单抗及雷珠单抗的生物活性检测。
本系统采用悬浮t淋巴细胞系jurkat细胞，jurkat细胞是悬浮细胞，无需贴壁过夜培养，节省检测实验时间。另外t淋巴细胞系对il-1r的胞内信号传导更灵敏。anti-cd3抗体和anti-cd28抗体与jurkat细胞表面cd3和cd28结合，双激活胞内nfat信号通路，进一步增强信号传导灵敏度。
具体的检测原理如下：首先由anti-cd3抗体和anti-cd28抗体激活jurkat细胞，然后加入配体vegf-165或pigf，配体通过与vegfr的结合，使得细胞内的il-1r3和il-1r6相互作用，进而激活下游的nfat信号通路，nfat蛋白进入细胞核进而与nfat-re结合，使得荧光素酶蛋白得以表达。加入荧光素酶底物，通过酶标仪对荧光信号进行记录，荧光信号的强弱与配体vegf-165或pigf与vegfr的结合呈正相关，当使用抗vegf抗体，抗体与配体vegf结合后，阻断vegf与其受体vegfr的结合，造成下游的荧光素酶蛋白表达量的减少，酶标仪检测的荧光信号减弱(见图1)。
实施例2检测方法优化
2.1浓度优化
根据实施例1.3的vegf-165激活实验结果，vegf-165设置200ng/ml、100ng/ml、25ng/ml三个不同的浓度，分别进行vegf单抗的抑制实验，根据测定的荧光值确定vegf-165的使用浓度。
方法：anti-cd3抗体和anti-cd28抗体包被96孔白板4℃过夜，每孔加入100000个vegfr2-nfat-jurkat-1-2细胞；贝伐珠单抗(购买于罗氏公司)初始浓度为125μg/ml，1：3梯度稀释10个浓度点，加入上述细胞板中；vegf-165分别稀释至200ng/ml、100ng/ml、25ng/ml，分别转移到上述细胞板中；37℃，5％co2培养箱6小时，每孔加50μl荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。
结果显示，vegf-165浓度选择100ng/ml，此时能够达到很好的荧光信号，也能节省vegf-165的用量(见图3)。
2.2抗体量效范围优化
将贝伐珠单抗稀释到较高的浓度1mg/ml，1：3稀释，20个浓度点，根据测定的荧光值拟合的四参数曲线确定贝伐珠单抗的作用范围。
方法：anti-cd3抗体和anti-cd28抗体包被96孔白板4℃过夜，每孔加入100000个vegfr2-nfat-jurkat-1-2细胞；vegf-165稀释至100ng/ml，转移到上述细胞板中；贝伐珠单抗稀释至1mg/ml，1：3梯度稀释17个浓度点，将稀释后的抗体转移至细胞板中；37℃，5％co2培养箱6小时，每孔加50μl荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。
根据ic50值及上下平台计算，确定贝伐珠单抗起始点终浓度为125μg/ml，1：4稀释，设十个浓度点，能够保证上下平台各有两个浓度点，线性部分至少三个点(见图4)。
2.3细胞密度优化
设置2×105个/孔、1×105个/孔、5×104个/孔、1×104个/孔四个不同的细胞密度，分别进行vegf单抗的抑制实验，根据测定的荧光值拟合的四参数曲线确定最优细胞密度。
方法：anti-cd3抗体和anti-cd28抗体包被96孔白板4℃过夜，将vegfr2-nfat-jurkat-1-2细胞分别按照2×105个/孔、1×105个/孔、5×104个/孔、1×104个/孔加入到96孔白板中。加入100ng/ml的vegf-165，贝伐珠单抗初始浓度为125μg/ml，1：4稀释10个浓度梯度，转移至上述细胞板中。37℃，5％co2培养箱6小时，每孔加50μl荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。
结果：根据上下平台计算得出的信噪比，vegfr2-nfat-jurkat-1-2细胞密度1×105个/孔至2×105个/孔范围内时，信噪比相差不多，细胞密度对信噪比影响不大(见图5)。选择细胞密度1×105个/孔进行后续实验。
实施例3检测方法的验证
3.1专属性验证
本方法是针对抗vegf抗体的生物学活性方法，因此，对其专属性的验证采用了不同靶点的单抗药物：贝伐珠单抗(bevacizumab，靶点为vegf)、托珠单抗(tocilizumab，靶点为il-6r)、利妥昔单抗(rituximab，靶点为cd20)、昔妥昔单抗(cetuximab，靶点为egfr)。在相同的实验条件下，利用我们的vegfr2-nfat-jurkat-1-2报告基因测活体系，测定这四种单抗药物的活性。
方法：anti-cd3抗体和anti-cd28抗体包被96孔白板4℃过夜，将vegfr2-nfat-jurkat-1-2细胞按照1×105个/孔加入到96孔白板中；加入100ng/ml的vegf-165；将4种单抗分别稀释至初始浓度125μg/ml，1：4稀释10个浓度梯度，分别转移至上述细胞板中；37℃，5％co2培养箱6小时，每孔加50μl荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。
本方法对il-6r、cd20、egfr靶点的抗体药物均没有剂量效应曲线，说明本方法不适于除了vegf靶点以外的其它药物，证明本方法专属性较好(见图6)。
3.2与传统方法的方法学比较
目前贝伐珠单抗的生物学活性测定方法主要是细胞增殖抑制的方法，该方法依据对vegf有生长依赖性的人脐静脉内皮细胞系huvec，加入贝伐珠单抗和vegf-165，贝伐珠单抗通过与vegf-165的结合，阻断vegf-165与细胞表面的vegfr结合，孵育72小时后，通过测定细胞的数量来定量贝伐珠单抗的细胞增殖抑制作用。我们分别使用传统方法和vegfr2-nfat-jurkat报告基因法测定同一批样品的相对效价，每个实验重复6次。
本申请的方法(转基因细胞法)：anti-cd3抗体和anti-cd28抗体包被96孔白板4℃过夜，将vegfr2-nfat-jurkat-1-2细胞按照1×105个/孔加入到96孔白板中；加入100ng/ml的vegf-165；贝伐珠单抗初始浓度为125μg/ml,1：4稀释10个浓度梯度，转移至细胞板中；37℃，5％co2培养箱6小时，每孔加50μl荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。
增殖抑制法：将huvec细胞按6×104个/孔接种于96孔板中；加入100ng/ml的vegf；贝伐珠单抗初始浓度为40μg/ml,1：4稀释10个浓度梯度，转移至细胞板中；37℃，5％co2培养箱72小时。将cck8显色液以20μl/孔加入细胞板，继续培养3小时，检测450nm/650nm波长测其吸光度。
结果显示：转基因细胞法测定结果与传统方法增殖抑制法测定结果具有很好的一致性，且转基因细胞法的相对变异系数要低于传统方法(见图7)。
转基因细胞法，一方面细胞采用悬浮培养的方式，便于细胞的培养，冻存，以及实验操作等；另一方面减少了整个实验周期，节约时间，提高工作效率；此外，转基因细胞法同传统的增殖抑制法比较，在实验结果的变异系数方面更有优势。
实施例4测定未知活性浓度的贝伐珠单抗。
anti-cd3抗体和anti-cd28抗体包被96孔白板4℃过夜，将vegfr2-nfat-jurkat-1-2细胞按照1×105个/孔加入到96孔白板中；加入100ng/ml的vegf-165；将未知活性浓度的贝伐珠单抗转移至上述细胞板中；37℃，5％co2培养箱6小时，每孔加50μl荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。将荧光信号值带入图4的曲线中，荧光值平均为17000，根据图4曲线，测定浓度为450ng/ml。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110>百奥泰生物科技（广州）有限公司
<120>一种测定抗vegf抗体活性的方法及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>756
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
metvalsertyrtrpaspthrglyvalleuleucysalaleuleuser
151015
cysleuleuleuthrglyserserserglyserlysleulysasppro
202530
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gluglylysasnlysmetalaserthrleuvalvalalaaspserarg
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ileserglyiletyrilecysilealaserasnlysvalglythrval
530535540
glyargasnileserphetyrilethraspvalproasnglyphehis
545550555560
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